基因工程2
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基因工程原理复习题
一、请简述正向遗传学和反向遗传学的特点
正向遗传学是指，通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变，然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能。
例如遗传病基因的克隆。
正向遗传学通常从表型材料入手，主要技术包括GWAS、Tail PCR （T—DNA插入法）和图位克隆等。
反向遗传学是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找有关的表型变化。
例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，反向遗传学则是从基因变化研究表型变化，主要技术包括同源基因克隆、RNAi和CRIPR技术。
二、请简述图位克隆基本原理
图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆，该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法。
其原理是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步移（chromosome walking）逼近目的基因或通过染色体登陆（chromosome landing）的方法最终找到包含目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。
三、请简述SSR分子标记原理及优缺点
SSR即微卫星DNA，是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。
可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSR标记。
优点1、微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中。
2、微卫星DNA具有丰富的多态性，并且微卫星位点检测可以显示纯合子和杂合子。
3、微卫星检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动化分析。
缺点：SSR标记的建立首先要对为微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工合成设计引物以及标记的定位、作图等基础性究，因而其开发有一定的困难，费用也很高。
四、请列举三种研究蛋白质与DNA相互作用的方法，并简述其原理
①酵母单杂交系统：
1.在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD蛋白质杂交体，而用
特异的DNA序列取代DNA Gal4结合位点。
2.该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。
3.靶DNA序列特异的结合蛋白与Gal4 蛋白的激活结构域可融合形成融合体，该蛋白
与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因
的表达。
②凝胶迁移实验-EMSA
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的
位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
染色质免疫共沉淀(chip)
基本原理是在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联，超声波将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后用所研究的目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀蛋白质DNA复合体，从而特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段
五、请介绍表观遗传包括的类型，并进行简单描述？
1、DNA甲基化：为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变
遗传表现，是一种外遗传机制。
是在DNA甲基化转移酶的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5-胞嘧啶的过程。
2、组蛋白修饰：是指组蛋白在相关酶作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、
泛素化、ADP核糖基化等修饰的过程。
3、ncRNA ：非编码核糖核酸，是指不编码蛋白质的RNA。
其中包括rRNA，tRNA，snRNA，
snoRNA 和microRNA 等多种已知功能的RNA，还包括未知功能的RNA。
这些RNA 的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA 水平上就能行使各自的生物学功能。
4、染色质重塑：基因表达的复制和重组等过程中，染色质的包装状态、核小体中组蛋
白以及对应DNA分子会发生改变的分子机理。
重塑包括多种变化，一般指染色质特定区域对核酶稳定性的变化。
5、RNA甲基化：RNA 甲基化是表观遗传学的重要内容之一，其中m6A（6-甲基腺嘌
呤）是较为常见的一种修饰方式
六、请简单介绍表观遗传的特点？
（1）可遗传，通过有丝分裂或减数分裂，在细胞或个体世代间遗传；
（2）基因表达发生改变，即基因活性或功能的改变；
（3）DNA序列没有变化。
