沙棘籽渣酶解产物的体内外抑菌作用
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采用二倍稀释法验证沙棘籽渣酶解物的抑菌作用，并测定沙棘籽渣酶解物 MIC[16]，即取 10 支无菌 试管编号，1~8 号为一定浓度梯度沙棘籽渣酶解物含菌液（含菌浓度为 108CFU/mL），即沙棘籽渣酶 解物浓度为 160、80、40、20、10、5、2.5、1.25mg /mL 的稀释液含菌试管；9 号取菌悬液 1mL 为不加 试验药物的菌液对照管，10 号管取沙棘籽渣多肽 1 mL 为不加菌悬液的药物对照管，摇匀后于 37℃培 养 24 h 后观察结果。判定标准为首先观察 9 号菌液对照管细菌呈混浊状生长，而 10 号药物对照管无细 菌生长，在呈透明状的前提下，以不出现混浊的最低沙棘籽渣多肽浓度为其 MIC。 1.3.5 体内抑菌试验
protamex and pepsin for enzymolysis, and using the method of Membrane separation for purification. Then get the
enzymolysis polypeptide with antibacterial activity. Results indicated that, protamex hydrolysate possesses
网络出版时间：2014-12-16 16:09 网络出版地址：/kcms/detail/11.2206.TS.20141216.1609.035.html
2014-12-16
沙棘籽渣酶解产物的体内外抑菌作用
陈 彤，王常青*，李小凡，郝志萍，訾艳，宁庆鹏，白芸芸
（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006） 摘 要：以沙棘籽渣为原料，采用水提法提取沙棘籽渣蛋白，再用 ProteAX 复合蛋白酶和胃蛋白酶两种酶酶 解，利用不同分子量的超滤膜对其分离纯化，得到具有抑菌活性的酶解物。体外试验结果表明，ProteAX 复 合蛋白酶水解液对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌均有抑制作用，胃蛋白酶水解液对大肠杆菌、金黄 色葡萄球菌、沙门氏菌有抑制作用。动物实验表明，用胃蛋白酶水解多肽灌胃的小鼠粪便中，沙门氏菌含菌 量与阳性组相比显著减少（p＜0.05）；而灌胃复合蛋白酶解物的鼠粪中，金黄色葡萄球菌含菌量比阳性组 显著降低（p＜0.05）。 关键词：沙棘籽酶解物；抑菌作用；体内外试验
多肽含量采用 QB/T2879-2007《海洋鱼低聚肽粉》中的三氯乙酸沉淀法测定。多肽分子量的测定 采用 Sephadex G-25 凝胶色谱法[13]，测检波长为 220nm。制作标曲的 Marker 为胸腺肽（3108Da）、杆 菌肽（1486Da）和还原性谷胱甘肽（307Da）。以 Marker 的相对分子质量对数（logMr）为横坐标，洗 脱体积（Ve）为纵坐标制作标准曲线，方程为 Ve=-30.55logMr+192.12。用峰面积归一法计算出多肽水 解液的分子量分布范围。
Staphylococcus aureus bacteria in mice feces were extremely significant (p < 0.05) compared with the model group,
enzymolysis polypeptide was given by gavage.
表 1 两种沙棘酶解产物的主要成分及含量(%) Table 1 Contents of main constituents in two kinds of seabuckthorn seeds polypeptide
酶的种类
多肽含量
＜1000Da
多肽含量及分子量分布
1000Da～5000Da
＞5000Da
作者简介：陈彤(1992—)，女，硕士研究生，研究方向为功能性食品开发。E-mail：chentong0307@
*通信作者：王常青(1956—)，男，教授，本科，研究方向为食品生物技术与功能食品的开发。E-mail：
wcq@
1
2014-12-16
葡萄球菌试纸片、沙门氏菌试纸片，广州绿洲科技股份有限公司；沙门氏菌显色培养基、营养琼脂培 养基、杆菌肽，北京奥博星生物技术有限公司；实验所用金黄色葡萄球菌，沙门氏菌、大肠杆菌、绿 脓杆菌均由中科院微生物所提供；其余化学试剂均为分析纯。 1.2 仪器与设备
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)
Abstract:With seabuckthorn seed as the raw material, using water method for seabuckthorn seed protein, using
1.3.3 体外抑菌圈实验 选大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌，以浓度为 20mg/mL 的沙棘籽渣酶解物进行
抑菌圈试验，采用平板打孔法，操作步骤参照文献[14]，每个孔内加入 20µL 的待检物，设无菌水为空白 对照组，1mg/mL 的杆菌肽溶液作为阳性对照，培养皿在 37℃培养 48h，测量各抑菌圈的直径，抑菌圈 的直径比空白对照组明显增大，则表示该沙棘籽渣多肽有抑菌作用 1.3.4 Inhibitory Concentration）测定
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂 沙棘籽渣为二氧化碳超临界提油后的残渣，粗蛋白含量 26.25%，山西五台山沙棘制品有限公司提
供；胃蛋白酶，酶活 3000U/g，广西庞博生物工程有限公司；ProteAX 复合蛋白酶，酶活 24000U/g， 日本天野酶制品株式会社。清洁级昆明种小鼠，20~25g，雄性，山西医科大学动物实验中心；金黄色
多肽得率
ProteAX 蛋白酶
0.82
75.50
7.27
17.23
54.67
胃蛋白酶
0.63
66.93
12.93
20.14
Key words： seabuckthorn seed polypeptide; bacteriostatic activity; experiment in vivo and in vitro
中图分类号：X792
文献标志码：A
文章编号：
沙棘是一种珍贵的药食两用的作物，其中含有维 A、维 C、维 E 等多种维生素，还有丰富的黄酮 类、原花青素等生物活性物质[1]。沙棘籽渣是沙棘榨油后的工业废物，常用作动物饲料[2]，但其中的蛋 白利用率很低。经测定，沙棘籽渣中含有 25%~30%的蛋白质[3]，如果能够将这些蛋白质有效地水解加 工成小分子的多肽，不但可以大大提高利用率，而且还有许多保健作用。近年来，国内外市场上的沙 棘提取物主要为沙棘籽油、沙棘果油、沙棘果粉、原花青素、沙棘黄酮、沙棘膳食纤维等[4-6]，关于沙 棘籽渣多肽的研究较少，对其功能性研究更少[7-9]，尚未见到关于沙棘籽渣抗菌肽方面的研究。本试验 以脱脂沙棘籽渣为原料，采用蛋白酶水解制备沙棘籽渣抗菌多肽，并对其体内外抑菌作用进行了研 究，旨在为能够充分利用沙棘蛋白资源，开发出天然植物源的抑菌剂，为沙棘的深度利用开辟一条新 径。
Sephadex 凝胶色谱系统与 UVD-680-3 紫外检测仪，上海金达生物科技有限公司；SP-2012UVPC 紫 外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；其它仪器为常规。 1.3 方法 1.3.1 沙棘籽渣酶解物的制备
沙棘籽渣经粉碎、过筛和去杂等预处理后，以料液比 1:15 加水，浸泡过夜，在前期实验摸索出的 蛋白酶最佳条件下加入蛋白酶水解[10-12]。胃蛋白酶的条件：温度 40℃，pH2.5，水解时间 3h，加酶量 3000U/g；ProteAX 蛋白酶的条件：温度 50℃，pH6.5，水解时间 4h，加酶量 3000U/g。水解多肽灭酶 后经微滤和孔径为 5000Da 的超滤膜超滤以除去大分子杂质，经孔径为 500Da 的纳滤膜纳滤以除去大 部分盐分、原花青素、黄酮等小分子杂质，得到试验用多肽，经测定蛋白纯度分别为 78.44%和 82.72%。 1.3.2 多肽得率及分子量分析
试验数据用 spss18.0 软件统计处理，试验结果以X+SD 表示，用 t 检验进行统计分析。
2 结果与分析 2.1 酶解物得率及多肽分子量分析
沙棘籽渣酶解物分子量的 G-25 凝胶色谱分析和峰面积归一法计算得知（图 1、表 1），ProteAX 蛋白酶酶解物得率和水解液中多肽含量比胃蛋白酶酶解液高 14.64%和 0.19%。两种酶水解液的多肽分 子量分布也有差异，其中 ProteAX 蛋白酶酶解液的多肽在＜1000Da 的分子质量比例比胃蛋白酶酶解液 的多肽高 8.57%；而胃蛋白酶酶解多肽在 1000Da～5000Da 和＞5000Da 分子段的百分率比 ProteAX 蛋 白酶酶解液的多肽高 5.66%和 2.91%。根据沙棘籽渣酶解物后分子量分布，猜测沙棘籽渣酶解物中起抑 菌活性成分可能为小于 1000ku 的短肽。
bacteriostasis in vitro of different degrees on Staphylococcus aureus, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa. And
pepsin hydrolysate possesses bacteriostasis in vitro of different degrees on Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
将已活化的金黄色葡萄球菌及沙门氏菌用无菌生理盐水配制成菌悬液，将该液适当稀释后在显微 镜下用血球计数板计数[15]，取同一菌悬液，配制稀释 2、4、8、16、32、64 倍的系列标样，在 600nm 波长下，以比色皿比浊，以无菌水为参比，分别测定其吸光度 A；以血球计数板所测的菌体浓度 C 的 对数值为横坐标，其对应的系列标样吸光度为纵坐标，绘制 A-logC 标准曲线。
Salmonella. Result of animal oxidation experiment showed that, Salmonella bacteria in mice feces were extremely
protamex and pepsin for enzymolysis, and using the method of Membrane separation for purification. Then get the
enzymolysis polypeptide with antibacterial activity. Results indicated that, protamex hydrolysate possesses
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沙棘籽渣酶解产物的体内外抑菌作用
陈 彤，王常青*，李小凡，郝志萍，訾艳，宁庆鹏，白芸芸
（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006） 摘 要：以沙棘籽渣为原料，采用水提法提取沙棘籽渣蛋白，再用 ProteAX 复合蛋白酶和胃蛋白酶两种酶酶 解，利用不同分子量的超滤膜对其分离纯化，得到具有抑菌活性的酶解物。体外试验结果表明，ProteAX 复 合蛋白酶水解液对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌均有抑制作用，胃蛋白酶水解液对大肠杆菌、金黄 色葡萄球菌、沙门氏菌有抑制作用。动物实验表明，用胃蛋白酶水解多肽灌胃的小鼠粪便中，沙门氏菌含菌 量与阳性组相比显著减少（p＜0.05）；而灌胃复合蛋白酶解物的鼠粪中，金黄色葡萄球菌含菌量比阳性组 显著降低（p＜0.05）。 关键词：沙棘籽酶解物；抑菌作用；体内外试验
多肽含量采用 QB/T2879-2007《海洋鱼低聚肽粉》中的三氯乙酸沉淀法测定。多肽分子量的测定 采用 Sephadex G-25 凝胶色谱法[13]，测检波长为 220nm。制作标曲的 Marker 为胸腺肽（3108Da）、杆 菌肽（1486Da）和还原性谷胱甘肽（307Da）。以 Marker 的相对分子质量对数（logMr）为横坐标，洗 脱体积（Ve）为纵坐标制作标准曲线，方程为 Ve=-30.55logMr+192.12。用峰面积归一法计算出多肽水 解液的分子量分布范围。
Staphylococcus aureus bacteria in mice feces were extremely significant (p < 0.05) compared with the model group,
enzymolysis polypeptide was given by gavage.
表 1 两种沙棘酶解产物的主要成分及含量(%) Table 1 Contents of main constituents in two kinds of seabuckthorn seeds polypeptide
酶的种类
多肽含量
＜1000Da
多肽含量及分子量分布
1000Da～5000Da
＞5000Da
作者简介：陈彤(1992—)，女，硕士研究生，研究方向为功能性食品开发。E-mail：chentong0307@
*通信作者：王常青(1956—)，男，教授，本科，研究方向为食品生物技术与功能食品的开发。E-mail：
wcq@
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葡萄球菌试纸片、沙门氏菌试纸片，广州绿洲科技股份有限公司；沙门氏菌显色培养基、营养琼脂培 养基、杆菌肽，北京奥博星生物技术有限公司；实验所用金黄色葡萄球菌，沙门氏菌、大肠杆菌、绿 脓杆菌均由中科院微生物所提供；其余化学试剂均为分析纯。 1.2 仪器与设备
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)
Abstract:With seabuckthorn seed as the raw material, using water method for seabuckthorn seed protein, using
1.3.3 体外抑菌圈实验 选大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌，以浓度为 20mg/mL 的沙棘籽渣酶解物进行
抑菌圈试验，采用平板打孔法，操作步骤参照文献[14]，每个孔内加入 20µL 的待检物，设无菌水为空白 对照组，1mg/mL 的杆菌肽溶液作为阳性对照，培养皿在 37℃培养 48h，测量各抑菌圈的直径，抑菌圈 的直径比空白对照组明显增大，则表示该沙棘籽渣多肽有抑菌作用 1.3.4 Inhibitory Concentration）测定
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂 沙棘籽渣为二氧化碳超临界提油后的残渣，粗蛋白含量 26.25%，山西五台山沙棘制品有限公司提
供；胃蛋白酶，酶活 3000U/g，广西庞博生物工程有限公司；ProteAX 复合蛋白酶，酶活 24000U/g， 日本天野酶制品株式会社。清洁级昆明种小鼠，20~25g，雄性，山西医科大学动物实验中心；金黄色
多肽得率
ProteAX 蛋白酶
0.82
75.50
7.27
17.23
54.67
胃蛋白酶
0.63
66.93
12.93
20.14
Key words： seabuckthorn seed polypeptide; bacteriostatic activity; experiment in vivo and in vitro
中图分类号：X792
文献标志码：A
文章编号：
沙棘是一种珍贵的药食两用的作物，其中含有维 A、维 C、维 E 等多种维生素，还有丰富的黄酮 类、原花青素等生物活性物质[1]。沙棘籽渣是沙棘榨油后的工业废物，常用作动物饲料[2]，但其中的蛋 白利用率很低。经测定，沙棘籽渣中含有 25%~30%的蛋白质[3]，如果能够将这些蛋白质有效地水解加 工成小分子的多肽，不但可以大大提高利用率，而且还有许多保健作用。近年来，国内外市场上的沙 棘提取物主要为沙棘籽油、沙棘果油、沙棘果粉、原花青素、沙棘黄酮、沙棘膳食纤维等[4-6]，关于沙 棘籽渣多肽的研究较少，对其功能性研究更少[7-9]，尚未见到关于沙棘籽渣抗菌肽方面的研究。本试验 以脱脂沙棘籽渣为原料，采用蛋白酶水解制备沙棘籽渣抗菌多肽，并对其体内外抑菌作用进行了研 究，旨在为能够充分利用沙棘蛋白资源，开发出天然植物源的抑菌剂，为沙棘的深度利用开辟一条新 径。
Sephadex 凝胶色谱系统与 UVD-680-3 紫外检测仪，上海金达生物科技有限公司；SP-2012UVPC 紫 外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；其它仪器为常规。 1.3 方法 1.3.1 沙棘籽渣酶解物的制备
沙棘籽渣经粉碎、过筛和去杂等预处理后，以料液比 1:15 加水，浸泡过夜，在前期实验摸索出的 蛋白酶最佳条件下加入蛋白酶水解[10-12]。胃蛋白酶的条件：温度 40℃，pH2.5，水解时间 3h，加酶量 3000U/g；ProteAX 蛋白酶的条件：温度 50℃，pH6.5，水解时间 4h，加酶量 3000U/g。水解多肽灭酶 后经微滤和孔径为 5000Da 的超滤膜超滤以除去大分子杂质，经孔径为 500Da 的纳滤膜纳滤以除去大 部分盐分、原花青素、黄酮等小分子杂质，得到试验用多肽，经测定蛋白纯度分别为 78.44%和 82.72%。 1.3.2 多肽得率及分子量分析
试验数据用 spss18.0 软件统计处理，试验结果以X+SD 表示，用 t 检验进行统计分析。
2 结果与分析 2.1 酶解物得率及多肽分子量分析
沙棘籽渣酶解物分子量的 G-25 凝胶色谱分析和峰面积归一法计算得知（图 1、表 1），ProteAX 蛋白酶酶解物得率和水解液中多肽含量比胃蛋白酶酶解液高 14.64%和 0.19%。两种酶水解液的多肽分 子量分布也有差异，其中 ProteAX 蛋白酶酶解液的多肽在＜1000Da 的分子质量比例比胃蛋白酶酶解液 的多肽高 8.57%；而胃蛋白酶酶解多肽在 1000Da～5000Da 和＞5000Da 分子段的百分率比 ProteAX 蛋 白酶酶解液的多肽高 5.66%和 2.91%。根据沙棘籽渣酶解物后分子量分布，猜测沙棘籽渣酶解物中起抑 菌活性成分可能为小于 1000ku 的短肽。
bacteriostasis in vitro of different degrees on Staphylococcus aureus, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa. And
pepsin hydrolysate possesses bacteriostasis in vitro of different degrees on Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
将已活化的金黄色葡萄球菌及沙门氏菌用无菌生理盐水配制成菌悬液，将该液适当稀释后在显微 镜下用血球计数板计数[15]，取同一菌悬液，配制稀释 2、4、8、16、32、64 倍的系列标样，在 600nm 波长下，以比色皿比浊，以无菌水为参比，分别测定其吸光度 A；以血球计数板所测的菌体浓度 C 的 对数值为横坐标，其对应的系列标样吸光度为纵坐标，绘制 A-logC 标准曲线。
Salmonella. Result of animal oxidation experiment showed that, Salmonella bacteria in mice feces were extremely
