一、目的：
1.了解双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理。
2.熟悉双缩脲法测蛋白质浓度的实验操作方法。
二、原理：
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、实验试剂和仪器
1. 硫酸铜、酒石酸钾钠、NaOH、KI、酪蛋白
2. 双缩脲试剂：取0.75g硫酸铜和3.0g酒石酸钾钠溶于250ml蒸馏水，加入150ml 10%NaOH溶液（可另加0.5gKI以防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水稀释至500ml。此试剂可以长期保存。
3. 10mg/ml标准蛋白溶液：取1.0gNaOH加入500ml蒸馏水中，配成0.05mol/lNaOH溶液。用0.05mol/lNaOH溶液溶解0.25g酪蛋白，定容至25ml。
4. 待测样品液：可以用酪蛋白配制，也可用蛋清，牛血清蛋白。
5. 仪器：容量瓶，试管，移液管，量筒，烧杯，胶头滴管，吸耳球，洗瓶，分光光度计
四、步骤
标准曲线的绘制（表1）。
表1
加入物 加入量（ml）
0 1 2 3 4 5
标准液 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.05mol/lNaOH 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
室温下振荡均匀，显色30min后，用分光光度计于540nm测定各管吸光度。以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
仅供个人参考
不得用于商业用途 实验二十 蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的
学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
二、实验原理
在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、实验试剂和器材
[试剂]
1．双缩脲试剂： 取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。
2．标准蛋白质溶液： 用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。
[器材]
1．试管：15×150mm 试管7只；
2．1ml，5ml移液管； 仅供个人参考
总蛋白测定试剂盒（双缩脲法）
适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清中总蛋白的含量。
1.1产品型号/规格及其划分说明
规格1 试剂1(R): 60ml×4 校准液：2ml×1
规格2 试剂1(R): 20ml×10 校准液：2ml×1
规格3 试剂1(R): 80ml×3 校准液：2ml×1
规格4 试剂1(R): 45ml×6 校准液：2ml×1
规格5 试剂1(R): 45ml×4 校准液：2ml×1
规格6 试剂1(R): 80ml×2 校准液：2ml×1
规格7 试剂1(R): 100ml×2 校准液：2ml×1
规格8 试剂1(R1):60ml×5 试剂2(R2): 20ml×5 校准液: 2ml×1
1.2主要组成成分
剂型 试剂 主要组成成分 浓度
液体单试剂 试剂1(R)
氢氧化钠
酒石酸钾钠
碘化钾
硫酸铜
防腐剂（Proclin 400mmol/L
89mmol/L
15.25mmol/L
6.075mmol/L
适量 300）
校准液 水基质
牛血清白蛋白
稳定剂（叠氮钠） 目标浓度：70g/L，具体定值见瓶签。
液体双试剂 试剂1(R1) 氢氧化钠
酒石酸钾钠 400mmol/L
89mmol/L
试剂2(R2) 氢氧化钠
酒石酸钾钠
碘化钾
硫酸铜 400mmol/L
89mmol/L
61mmol/L
24.3mmol/L
校准液 水基质
牛血清白蛋白
稳定剂（叠氮钠） 目标浓度：70g/L，具体定值见瓶签。
2.1外观 2.1.1 外观（液体单试剂）
. R应为蓝色透明溶液，无混浊，无未溶解物；
. 校准液应为浅黄色透明溶液，无混浊，无未溶解物；
. 试剂盒标签标识清晰，外包装完整无损。
2.1.2 外观（液体双试剂）
a）R1应为无色溶液，无混浊，无未溶解物；
双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价
吴文钦
（广东医学院医学检验学院 广东-东莞 523808）
摘要：目的 对双缩尿法测定血清总蛋白进行方法性能评价，达到提高分析方法质量的目的。方法 配制双缩脲试剂，并用所配制的双缩脲试剂与标准血清总蛋白进行批内重复性试验、回收试验以及线性范围评价试验，从而评价双缩尿法测定血清总蛋白的精密度、准确度和线性范围。结果 用分光光度计测定波540nm处的吸光度A，进行相关数据分析，双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数 CV%为2.36%，回收试验平均回收率为105%，线性范围评价试验R2为0.9980。结论 在严格规范操作下，双缩脲法测定血清总蛋白的精密度高，准确度以及线性范围较好，满足临床对血清总蛋白定量测定要求，是临床测定血清总蛋白的常规方法。
关键词：双缩脲法；血清总蛋白；方法学评价
Biuret method was developed for the determination of protein evaluation
methodology
Abstract Objective The purpose of the double reduction of urine protein
determination of serum total performance evaluation methods, to improve
the quality of analytical methods.Methods Biuret test preparation, and
formulated with the biuret test standard serum total protein in the assay
reproducibility test, recovery test and linear range of evaluation test
