土壤酶活性测定的实验步骤

土壤酶活性测定的实验步骤

土壤酶的测定

1.将三角瓶在稀释的硝酸（3-5%）或洗衣粉中浸泡24小时，然后刷洗，然后用蒸馏水湿润并在空气中干燥。2.土样应细磨并袋装。土壤量：2G+2.5G+5G+5G=14.5G，重复一次，14.5×2=29g

一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫p323）

1.试剂制备：

(1)0.3%过氧化氢溶液：

① （1:10030%过氧化氢和水）② （0.5mol H2O2+49.5ml蒸馏水）③ （1ml

30%H2O2+99ml蒸馏水）（2）3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水）（3）0.1N高锰酸钾溶液：（1.58gkmno4+100ml蒸馏水）

2．操作步骤：

将2G风干土壤放入100个三角形烧瓶中→ 40毫升蒸馏水和5毫升0.5毫升蒸馏水注入3%过氧化氢（现配备）→ 在往复式振动筛上振荡20分钟→ 添加5ml 3N硫酸（以稳定未溶解的H2O2）→ 用慢滤纸过滤→ 吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉色

3．结果计算

过氧化氢酶活性（m），20分钟后在1g土壤中以毫升0.1nkmno4表示：m=（a-b）×T，其中：

a：空白消耗的0.1nkmno4毫升数

b：滤液消耗的0.1nkmno4 ml T：高锰酸钾滴定的校正值

备注：

H2O2的酶活性是用容量法测定的：kappen（1913）首先介绍了在硫酸存在下用高锰酸钾滴定残余过氧化氢的方法。根据H2O2与土壤相互作用过程中未分割H2O2的含量，采用容量法（常用高锰酸钾滴定未分割H2O2）2kmno4+5h2o2+3h2so4测定H2O2的酶活性→

2mnso4+K2SO4+8H2O+5o2

土壤h2o2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用

二、 蔗糖酶（p278）滴定法

1.试剂配制： （1） 20%蔗糖：（20克蔗糖+80毫升水或12.5克蔗糖+50毫升水）（2）甲苯（分析纯）

(3)ph5.5醋酸盐－磷酸盐缓冲液

0.5ml磷酸氢二钠12H2O（1/15m）+9.5ml磷酸二氢钾（1/15m）

磷酸氢二钠12h2o(1/15m)：23.88gna2hpo4,，加h2o溶解，定容至100ml。磷酸二氢钾（1/15m）：9.072gkh2po4，加h2o溶解，定容至1000ml。(4)33%ki溶液（4.925g+10ml水）现配，冰箱遮光(5)h2so4（1：3）（体积比）：15ml98%h2so4+45ml蒸馏水(6)淀粉指示剂

将0.5克淀粉溶于少量水中，加入10毫升煮沸的2.5%氯化钠溶液，煮沸1分钟。（2.5%氯化钠：2.5%氯化钠加97.5毫升蒸馏水。）（7） 0.1nnas2o3滴定剂

取25克-----溶解于刚煮沸而冷却的蒸馏水中，加入少量的碳酸钠，稀释至1升。(8)菲林溶液

在蒸馏水中溶解3.464g CuSO45H2O并稀释至50ml（a），在蒸馏水中溶解17.3g酒石酸钾钠和5gnaoh并稀释至50ml（b）。使用前将（a）（b）1:1混合。

2.操作步骤

取2.5G土壤，放入100ml三角瓶中→ 用0.375ml甲苯处理15分钟。加入2.5毫升20%蔗糖和2.5毫升pH值5 5摇匀醋酸铅-磷酸缓冲液，并将其放入37度培养箱中培养24小时。

培养结束后，加12.5ml蒸馏水。

摇匀过滤，将5ml滤液移入100ml三角瓶中，加入2.5ml薄膜溶液，置于沸水浴中10min，冷却至室温，然后加入0.75ml 33%碘化钾溶液和1ml硫酸（1:3）。加入2滴淀粉指示剂，用0.1nnas2o3滴定。

颜色：棕色→棕蓝色→乳白色（滴定结束）

注：减量滴定一般用5ml即可，滴定时需要大量Na2O3溶液。空白对照：30.15ml（服用5ml时）

3．结果计算：

蔗糖酶活性（m），表示为对照组和试验组之间0.1nnas2o3滴定的毫升数之间的差值。试验中应使用20ml水代替基质。

m=（a－b）×t×17.875/5/2.5式中： a：对照品消耗的0.1nnas2o3 ml的数量B：滤液消耗的0.1nnas2o3 ml的数量T：Na2O3滴定的校正值

×17.875/5/2.5：换算成1g土消耗的0.1nnas2o3量

三、 尿素酶

1.试剂配制

（1） PH=6.7柠檬酸盐缓冲液

取3.68g柠檬酸溶液于6ml蒸馏水中，另取2.95g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1n氢氧化钠将ph调至6.7，并将水稀释至20ml。(2)苯酚钠溶液

称取62.5g苯酚，溶于少量乙醇中，加入2ml甲醇和18.5ml丙酮，然后用乙醇稀释至100ml（液体a），保存于冰箱中。

称27gnaoh溶于100ml水中（b液），存于冰箱中。

使用前，取溶液a和溶液B各20ml，用蒸馏水稀释至100ml备用。（3） 次氯酸钠溶液

用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。（17.3mlnaclo定容至100ml）。(4)10%尿素液

10g尿素+90ml水，50g尿素+450ml水

(5)甲苯

（6） 氮标准溶液（不配制）

精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，则得1ml含0.1mg氮的标准液。绘制氮的标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。

2.操作步骤

取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。15min加10ml10%尿素液和20mlph6.7柠檬酸缓冲液。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。

过滤后，将3ml滤液注入50ml锥形瓶中，加入20ml蒸馏水、4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，加入时摇匀。

20min后显色，定容50ml：1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。然后按绘制标准曲线（显色方法）进行比色测定。

3.结果计算： 脲酶活性（m）以24h后1g土壤中nh3－n的毫克数表示m=x×31/3/5

标准曲线：y=0.0268x+0.001804

即：m=（0.001804-y）×31/3/5/0.0268式中：

标准曲线中的x:Mg NH 3-N Y:578nm处的吸光度

×31/3/5：换算成1g土的系数

四、 磷酸酶

1.试剂配制

（1） PH=9.8氯化铵-氢氧化钠缓冲液

取20gnaoh溶于100mlnh4oh中(2)8%铁氰化钾液

称取8g铁氰化钾，溶于蒸馏水中，稀释至100ml（仅在同一周内储存）（3）2%4-氨基安替比林溶液

取1g4－氨基安替比林溶于水中，稀释至50ml（仅在同一周内存放）(4)0.5%磷酸苯二钠溶液取1g溶于200ml水中(5)酚的标准溶液（不要配）

苯酚原液的制备和苯酚工作液的稀释浓度与磷酸二钠法相同

酚原液：取1g重蒸酚溶于水中，稀释至1l存于棕色瓶中

苯酚工作液：将10ml苯酚储备液稀释至1L（0.01mg/ml苯酚）（6）甲苯

标准曲线绘制

吸取1,3,5,7,9,11,13ml苯酚工作液，分别放入50ml容量瓶中，分别加入20ml蒸馏水，加入0.25ml缓冲液、0.5ml 4-氨基安替比林溶液和0.5ml铁氰化钾溶液，每次充分摇匀。最后，将体积定为50ml，并在15分钟内在分光光度计上比较510nm波长下的颜色。根据光密度值和溶液浓度绘制标准曲线。

50－（20＋2＋0.5＋0.5＋0.25）=26.75ml蒸馏水

2.操作步骤

取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加5滴甲苯。20ml0.5%磷酸苯二钠，充分振荡后在37℃恒温箱中培养2h。

培养后取滤液5ml，置于50ml锥形瓶中，加入20ml蒸馏水，加入0.25ml缓冲液、0.5ml 4-氨基安替比林溶液和0.5ml铁氰化钾溶液，每次充分摇匀。最后，将体积定为50ml，并在15分钟内在分光光度计上比较510nm波长下的颜色。 3．计算

磷酸酶活性（m），以100g土壤中P2O5的mg表示，2h后，m=x×80×零点三二×两点二九

标准曲线：y=0.002161x-0.000839

即：M=（y+0.000839）×八十×零点三二×2.29/0.002161，其中：

x：从标准曲线查得5ml滤液中酚的完整数y：510nm处吸光度

80：剩余部分转化为100g土壤

0.32：在磷酸苯二钠中，1个重量单位的酚相当于0.32g重量单位的磷2.29：将p换算为p2o5的系数