遗传毒性试验

•672 •第 44 卷第 3 期2021 年3 月《袷Drug Evaluation Research Vol. 44 No. 3 March 2021遗传毒性评价Ames试验方法的比较分析高梅“2,曹冲、王功霞\马会\英永”1.山东省药学科学院山东省化学药物重点实验室，山东济南2501012.山东师范大学生命科学学院山东省动物抗性生物学重点实验室，山东济南250014摘要：A m e s试验是一项体外致突变性试验，被广泛用于药物、食品、化学品和农药的遗传毒性检测，以评价受试物致突 变的可能性。

药物、食品、化学品和农药的指导原则和国家标准中A m e s试验方法不尽相同，就这几者A m e s试验方法的主 要异同点进行比较分析，以期能熟练掌握A m e s试验实施要点，更加规范实施检测工作，不断提高试验质量。

关键词：A m e s试验；药物；食品；化学品；农药中图分类号：R962.2 文献标志码：A文章编号：1674-6376 (2021) 03-0672-05D O I：10.7501/j.issn. 1674-6376.2021.03.031Comparison and analysis of Ames test for genotoxicity evaluationGAO Mei12,CAO Chong1,WANG Gongxia1,MA Hui1,YING Yong11. S h a n d o n g A c a d e m y of Pharmaceutical Sciences, S h a n d o n g Provincial K e y Laboratory of C h e m i c a l Drug, Jinan 250101, China2. S h a n d o n g N o r m a l University, College of Life Sciences, S h a n d o n g Provincial K e y Laboratory of A n i m a l Resistance Biology,Jinan 250014, ChinaA b str a c t:A m e s test is a mutagenicity test in vitro, w h i c h i s widely used in the detection of genotoxicity of drugs, food, chemicals and pesticides to evaluate the possibility of mutagenicity of test substance. T h e guiding principles an d national standards of A m e s test on drugs, food, chemicals and pesticidesand are different. In this paper, the m a i n similarities and differences w ere c o m p a r e d and analyzed in order to master the key points of A m e s test implementation, so w e can i m p l ement the testing w o r k standardly and improve the test quality constantly.K ey w o r d s:A m e s test; drugs; food; chemicals; pesticides细菌回复突变试验又称Am es试验，是一项检 测基因突变的体外致突变性试验，以评价受试物致 突变的可能性。

致突变试验：根据受试物的化学结构、理化性质及对遗传物质作用终点（基因突变和染色体畸变）的不同。

要求新药必须做下列三项试验。

（１）微生物回复突变试验菌株：组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（Ｓｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）四株（ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２），亦可采用大肠杆菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＷＰ２若干株（大肠杆菌试验）。

剂量：决定受试物最高剂量的标准是细菌毒性和溶解度。

一般最大剂量可达５ｍｇ／皿。

受试物至少应有五种不同剂量否则应说明选定剂量的理由。

代谢活化：应用诱导剂处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（Ｓ９）进行体外代谢活化试验，即在加Ｓ９混合物和不加Ｓ９混合物平行的条件下测试。

对照组：用溶媒作阴性对照，用已知突变原作阳性对照。

结果判定：受试物的回复突变菌落数的增加与剂量相关并有统计学意义，或至少某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的阳性反应时记为阳性。

（２）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验细胞：哺乳动物原代或传代培养细胞。

剂量：至少应用三种不同剂量，高剂量以５０％细胞生长抑制浓度为基准，否则应说明选定剂量的理由。

标本制作时间：药物与细胞接触后应有适当时间最好包括整个细胞周期，通常在药物处理后２４和４８小时制作染色体标本。

代谢活化：应用适当的代谢活化法。

对照组：用溶媒作阴性对照，已知突变原作阳性对照。

镜检：每种浓度至少观察１００个中期分裂相细胞的染色体结构的异常及多倍体的出现率。

结果判定：受试物诱发的染色体畸变的出现率较阴性对照有统计学意义的增加，并有剂量反应关系时记为阳性，同时标明异常细胞出现的频度和种类。

（３）体内试验一般选用微核试验，但作用于生殖系统的药物进行显性致死试验等。

ａ．啮齿类动物微核试验动物：一般用小鼠，每组１０只性成熟动物（雌雄各半）或至少６只性成熟雄性动物。

给药剂量及途径：至少采用三种剂量，最高剂量从１／２ＬＤ５０为基准，腹腔和／或口服一次给药，必要时可连续给药。

否则应说明选定剂量的理由。

保健食品安全性毒理学评价试验的四个阶段和内容发布日期：2021-04-03浏览次数:1605字号：[大中小]毒理试验的四个阶段和内容1第一阶段：急性毒性试验口服急性毒性：LD50，联合急性毒性，一次性最大耐受性受量试验。

二阶段II：遗传毒性试验，30天喂养试验，传统畸试验遗传毒性试验的组合应考虑原核和真核细胞的结合原理，体内试验和体外试验。

来自Ames试验或V79/HGPRT基因突变试验、骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验、4.1.2.3或4.1.2.4试验别各选一项。

2.1基因突变试验：首选鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验），其次是V79/HGPRT基因突变试验，必要时可另选其它试验。

2.2骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验。

2.3tk基因突变试验。

2.4小鼠精子畸形分析或睾丸染色体畸变分析。

2.5其它备选遗传毒性试验：显性致死试验、果蝇伴性别隐性致死试验，非程序DNA合成试验。

2.630天喂养试验。

2.7传统致畸试验。

三第三阶段：亚慢性毒性试验-90天喂养试验和繁殖试验殖试验、代谢试验四第四阶段：慢性毒性试验（包括致癌试验）1、药物的毒性试验分为两类，其一特殊毒性试验，包含致癌、致残、致突变，号称三致试验；作此试验的单位必须是国家指定并认可的；一般单位即使做了也不被国家认可！通常一类创新药必须做的。

无论一个药物的药效如何好，只要含有三致试验的特殊毒性（动物若干代繁殖后，查看），该药物将不会允许上市的。

2、其二，一般毒性试验，通常用老鼠或兔子去做，主要是测定半数致死量；若某个药物的半数致死量是有效使用剂量的2倍以上，通常认为是临床使用安全的，若半数致死量比有效剂量略大一点，那就谁也不敢使用了，万一略微超一点量就会导致患者死亡！。

遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。

根据检测的遗传学终点分为4种类型:1检测基因突变（比如：Ames试验）;2检测染色体畸变（比如：微核试验）;3检测染色体组畸变（比如：体外CHL细胞染色体畸变、精原细胞染色体畸变试验）;4检测DNA原始损伤（比如：单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)）。

以上检测结果为呈阳性（除外假阳性）的化合物，为潜在人类致癌剂和/或致突变的物质。

FDA于2006年制定了遗传毒性试验结果的综合分析法指导原则（Guidanceforindustyandreviewstaff:Recommendedapproachestointegrationofgenetict oxicologystudyresults）对遗传毒性试验的阳性结果评价和处理：ICHS2（R1）中的遗传毒性结果评价和追加试验策略。

目前已建立的遗传毒性短期检测法已超过200种。

1 现行组合试验方案，用一组试验配套进行试验。

200多种检测方法中,真正经过验证有合适灵敏度和特异度的大概不到10种。

目前多数国家规定,如体内诱变试验显示1个或以上试验呈阳性结果,则需要进行生殖细胞遗传毒性测试。

2 各类遗传毒性试验方法的研究进展2.1 检测基因突变2.1.1 Ames试验Ames试验是检测化学物质基因突变的常用方法。

常规的Ames试验选用四个测试菌株(TA97、TA98、TA100、TA102),最近有人提出增加TA1535测试菌株,该菌株特别适用于检测混合物的致突变性。

目前出现的新生菌株具有更高的敏感性和特异性,如YG7014、TG7108,缺乏编码O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的ogtST基因,专用于对烷化剂引起的DNA损伤检测;引入乙酰转移酶基因的YG1024、YG1029菌株,对硝基芳烃和芳香胺的敏感性比原菌株高100倍以上[4]。

测试代谢活化系统一般采用由Aro-clor1254(PCBs)诱导大鼠肝微粒体酶的S9;国外也有用人肝S9的报道,试验证明其代谢活性明显高于鼠S9[5,6]。

遗传毒性的检测与评价的方法和技术随着人们对环境与健康的关注日益增强，购买被污染的食品或暴露于有毒化学物质的环境等情况，都会对人们的健康产生严重的影响。

其中，遗传毒性的影响最为严重，因为它不仅可以在一代人身上造成影响，而且有可能在后代身上造成更为严重的遗传变异。

为了及时发现和评价遗传毒性，人们通过检测和评价遗传毒性的方法和技术，来减轻遗传毒性对人们和社会的伤害。

一、遗传毒性的表现遗传毒性是指会对生物基因产生损害，从而影响其后代的发育和生长的不良效应。

遗传毒性通常表现为突变、染色体畸变和基因底物变异等形式。

这种损害可能会在种群中的后代中不断扩散，甚至会导致疾病和畸形的出现。

二、遗传毒性的检测方法和技术为了早期发现和减轻遗传毒性的影响，人们掌握了各种方法和技术来检测和评价遗传毒性。

此类方法主要有动物试验法、细胞试验法、遗传毒性评价法、基因工程和生物信息学等。

1. 动物试验法动物试验法是通过对小白鼠、梅花鹿等实验动物进行观察，来检测和评价遗传毒性的程度。

这种试验有其优点，它可以确定毒性物质对生物的具体影响。

不过，由于反应对动物试验法的争议以及其无法扩大规模，该方法并不能适用于现代遗传毒性检测和评价。

2. 细胞试验法细胞实验法是通过在细胞级别检测有毒化学物质是否引起基因突变的方法。

这种方法能够较好地检测化学物质的遗传毒性，可以检测和评价提高，还有其他可能。

然而，细胞试验法不适用于所有型号的毒性物质。

3. 遗传毒性评价法遗传毒性评价法是一种检测有毒化学物质的遗传毒害，以及评价该物质对基因突变的影响的方法。

这种方法的优点是它不需要进行任何动物试验或排放量试验，但它需要很多时间和努力来进行。

4. 基因工程基因工程是通过改变生物体的染色体，控制或预防有毒化学物质的遗传毒性。

这种方法可以在生物内部进行，并且可以达到我人们期望的效果，但技术复杂，目前还处于研究阶段。

5. 生物信息学生物信息学是利用计算机科学和数学技术，通过研究和分析生物系的基因组和表达模式，来了解遗传毒性的原因。

附件四药物遗传毒性研究技术指导原则药物遗传毒性研究技术指导原则一、概述遗传毒性研究（Genotoxicity Study）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。

拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。

遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。

以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一（这种遗传学改变仅在复杂的恶性肿瘤发展变化过程中起了部分作用）。

在检测此类损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在致癌剂和/或致突变剂，即可能诱导癌和/或遗传性疾病。

由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。

但是，因为已经确定生殖细胞突变与人类疾病有关，所以对可能引起可遗传效应的化合物与可能引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外，这些试验的结果可能还有助于解释致癌性的机制和试验结果。

因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。

本指导原则重点阐述遗传毒性试验体内外试验的基本原则，并介绍标准试验组合方案，以及对试验结果的综合分析及评价。

本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物的遗传毒性试验研究。

二、基本原则（一）实验管理药物的遗传毒性试验属于安全性评价研究，根据《中华人民共和国药品管理法》的规定，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。

（二）具体问题具体分析遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。

发布日期20080729栏目化药药物评价>>综合评价ICH关于遗传毒性体外、体内试验的建议--ICHS2（R1）人用药物遗传毒性标题试验和结果分析指导原则介绍（二）作者黄芳华部门正文内容审评二部黄芳华前文已介绍了ICH关于遗传毒性标准试验组合的要求，以下介绍ICHS2（R1）Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation forPharmaceuticals Intended for Human Use（人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则）中关于体外、体内试验的建议。

一、对体外试验的建议1、试验重复和分析实验结果的重现性是涉及新方法或意外发现的研究的基本组成部分。

但是，用标准的、已广泛应用的遗传毒性试验进行常规试验时往往不需要完全重复。

这些试验都经过很好的充分验证且有有效的内部控制，对明确的阳性或阴性结果试验通常不需要重复。

理想状态是可明确宣称试验结果是明确的阳性或明确的阴性。

但是，试验结果有时达不到阳性或阴性称谓的预先设定的标准，因此被定为“可疑”。

统计学方法的应用有助于数据分析；但是，充足的生物学分析是至关重要的。

可疑试验的重复可致(i) 一个明确的阳性结果，因此作为整体阳性结果；(ii) 一个阴性结果，所以结果不需要重复和总体结果为阴性；或(iii)另一个可疑的结果，最后结论仍维持可疑。

2、对细菌突变试验的推荐方案OECE指导原则（1997）和IWGT报告(Gatehouse et al, 1994) 给出了对方案的建议。

2.1 高剂量水平的选择最高剂量水平当不受溶解度或细胞毒性限制时，推荐最高浓度为5000µg/皿。

溶解度的限制对于细菌培养，如果沉淀不干扰评分应对沉淀量进行评分，毒性不限制，最高剂量不超过5000µg/皿。

有证据表明在用细菌遗传毒性试验检测某些受试物时，在不溶解的浓度范围内也能检测出剂量相关性的遗传毒性。

农药登记毒理学试验方法农药是一种用于保护农作物、畜牧、林业以及家庭中害虫、草药和微生物的化学物质。

由于农药的使用会产生潜在的环境和人类健康风险，因此，对于农药的授权需要进行严格的评估和审批过程。

其中，毒理学试验方法是评估农药对生物毒性的主要工具之一。

毒理学试验方法是基于生物学理论和毒性机制的，可分为急性毒性和慢性毒性试验。

急性毒性试验通过直接暴露测试对象（如实验室动物和细胞）来评估化合物在短时间内对生物的影响。

慢性毒性试验则更关注长期使用农药对人类和环境的影响，因此需要更长的试验时间。

以下是几种常用的毒理学试验方法：1.急性毒性试验急性毒性试验一般应用于生物体内某些口服、吸入或皮肤接触的化学物质，试验结果可以产生毒性分类标准和确定最大容忍剂量（MDT），从而确认农药使用的安全性。

目前国际通行的急性毒性试验是斯图尔特法。

斯图尔特法是使用实验动物体内的Lethal Dose（LD）作为毒性的指标，其安全系数根据不同物种和试验组进行调整。

2.染色体畸变试验染色体畸变试验通过评估农药对动植物细胞核DNA的影响来评估农药的致突变效应。

这些效应包括染色体片段、染色体断裂、染色体畸变等。

该试验是在实验室中使用动植物细胞的分裂期进行的。

3.遗传毒性试验遗传毒性试验通过评估农药对DNA的影响来评估其致突变效应。

与染色体畸变试验不同，遗传毒性试验可以检测出突变后DNA序列的改变。

此次试验一定会使用实验动物进行。

4.慢性毒性试验慢性毒性试验的设计是为了持久性接触或摄入导致的毒性。

gavage试验和繁殖试验是用于进行此类试验的一种环节。

长期饮用毒性实验是毒理学试验中使用的最常见的方法之一。

它的主要目的是评估长时间使用农药对生物的健康影响。

这种试验可以进行几个月甚至几年的长期暴露。

总体而言，农药的毒理学试验方法是在安全性评估中不可避免的一环。

通过这些试验，我们可以更好地理解和掌握该物质的潜在危险。

然而，毒理学试验环节需要仔细设计，以使试验结果有实用意义，同时避免动物的不必要痛苦和伤害。