The YeastTwo-Hybrid System

酵母转录因子（Gal 4）
与BD-fusion ---诱饵蛋白（bait protein ） 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein）
报告基因（reporter gene）
---Lac Z（编码β -半乳糖苷酶）
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿 主细胞。 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点:
酵母双杂交系统
一、酵母双杂交系统的简介
酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system) 是由Fields和song等在1989年提出的一种在真 核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋 白质相互作用的遗传系统。 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细 胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许 多真核生物的转录因子都是由两个可以分开 的、功能上相互独立的结构域组成的。
DNA结合结构域(BD)
(DNA binding domain)
转录激活因子
转录激活结构域(AD) (activation domain)
•这两个结构域各具功能，互不影响,
•单独存在时都没有转录激活的功能，
•只有二者在空间上充分接近时，才表现出一个完整的
激活特定基因表达的激活因子的功能。
二、酵母双杂交系统的建立
五、酵母双杂交的应用
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的， 研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、 瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检 测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间 关系的技术。
大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用 来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也 可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互 作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。

酵母双杂实验操作⼿册和注意事项酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作⼿册和注意事项⼀. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建⽴了第⼀个基于酵母的细胞内检测蛋⽩间相互作⽤的遗传系统。

很多真核⽣物的位点特异转录激活因⼦通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。

这两个结构域各具功能，互不影响。

但⼀个完整的激活特定基因表达的激活因⼦必须同时含有这两个结构域,否则⽆法完成激活功能。

不同来源激活因⼦的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。

基于这个原理，可将两个待测蛋⽩分别与这两个结构域建成融合蛋⽩，并共表达于同⼀个酵母细胞内。

如果两个待测蛋⽩间能发⽣相互作⽤，就会通过待测蛋⽩的桥梁作⽤使AD与BD形成⼀个完整的转录激活因⼦并激活相应的报告基因表达。

通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋⽩分⼦间是否发⽣了相互作⽤。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋⽩表达载体，被表达的蛋⽩称诱饵蛋⽩(bait)。

(2)与AD融合的蛋⽩表达载体，被其表达的蛋⽩称靶蛋⽩(prey)。

(3)带有⼀个或多个报告基因的宿主菌株。

常⽤的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。

⽽菌株则具有相应的缺陷型。

双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。

这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。

根据⽬前通⽤的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。

后者因其BD来源于原核⽣物，在真核⽣物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

⼆.所⽤的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)⼆缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显⾊所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.⽔浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。

产生的GAL4 DNA-BD和AD多肽 不直接发生相互作用，不能激活相关的效 应基因进行转录

同时用上述两种载体转化改造后的酵
母，这种改造后的酵母细胞的基因组 中不能产生GAL4结合形成杂种 蛋白，与GAL1的UAS序列结合，但由于无 AD的参与，报告基因不转录。 蛋白质X DNA-BD
基本原理
DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147 氨基酸 转录激活域（AD）：C端786-881氨基 酸




DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的 激活序列（UAS） ，并与之结合 AD：通过同转录机制(transcription machinery)的其它成分之间的结合以启 动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。

用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分 开，并放在同一宿主细胞中表达。

将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质 Bait protein的基因构建在同一个表达 载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白 BD-Bait proteiRARY表达载体上。
上游更远处 增强子 统称顺式作用元件
转录因子




能直接或间接辨认和结合上游区段DNA 的蛋白质----反式作用因子. 其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的 称为转录因子(TF). 相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为 TF Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 真核生物的TFⅡ又分为TFⅡ A与TFⅡ B
真核生物转录起始前复合物
（ADH1:醇脱氢酶1）
实验程序



1 2 3 4 5
分别重组两种穿梭质粒载体。 分别导入E.coli培养。 分别提取两种质粒。 转化酵母菌 筛选阳性克隆
应用---蛋白质相互作用

酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。

典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。

前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。

而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。

主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。

上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。

融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。

例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。

因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。

报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。

最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。

〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。

〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。

一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。