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农药敌敌畏对铜绿微囊藻生长的影响

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生态与农村环境学报　2010,26(3):264-267Journal of Ecology and Rural Environm ent农药敌敌畏对铜绿微囊藻生长的影响吴　丽,张丽华,李建宏①,潘　澄,赵　婕,李珊珊,宋晓芬　(南京师范大学生命科学学院,江苏南京　210046)摘要:分别以2株铜绿微囊藻(M icrocystis aeruginosa )———单细胞株PCC7806和群体株X W 01为材料,研究了不同质量浓度有机磷农药敌敌畏(DDV )对水华蓝藻微囊藻生长的影响。

结果表明,在BG11培养液中,高浓度(≥50mg ・L-1)DDV 抑制群体株X W 01生长,低浓度(≤10mg ・L -1)DDV 则促进X W 01生长。

单细胞株PCC7806比群体株X W 01对DDV 的作用更敏感,≥10mg ・L -1DDV 即可抑制PCC7806的生长。

低浓度DDV 的促生长作用并不是DDV 增加磷营养所致。

在缺磷培养条件下,低浓度(≤50mg ・L -1)DDV 对微囊藻具有更明显的促生长作用。

DDV 对微囊藻胞内和胞外碱性磷酸酶活性均有促进作用。

DDV 残留一旦进入水体将可能对蓝藻水华的形成产生一定的促进作用。

关键词:敌敌畏;微囊藻;碱性磷酸酶;蓝藻水华中图分类号:X -651;X82 文献标识码:A 文章编号:1673-4831(2010)03-0264-04Effects of Pesti c i de DD V on Growth of M icrocystis aeruginosa .WU L i ,ZHAN G L i 2hua ,L I J ian 2hong ,PAN Chen ,ZHAO J ie ,L I Shan 2shan ,SON G X iao 2fen (College of L ife Sciences,Nanjing Nor mal University,Nanjing 210046,China )Abstract:Effects of organic phos phor pesticide DDV on bl oom ing of cyanobacteriu m M icrocystis were studied .Gr owths of M icrocystis aeruginosa PCC7806,a unicellular strain and M icrocystis aeruginosa X W 01,a col onial strain,were investiga 2ted as affected by different concentrati ons of DDV.Results show that the gr owth of M icrocystis was inhibited by DDV high in concentrati on,but p r omoted by DDV l ow in concentrati on in BG11culture mediu m.PCC 7806was more sensitive t o DDV than X W 01.The effect was more obvi ous in the culture mediu m deficient in phos phate than in the BG11.The in 2creased gr owth did not result fr om phos phor supp lement by DDV,but DDV sti m ulated activities of the intracellular and ex 2tracellular alkaline phos phatase of M icrocystis,which suggests that once DDV residue enters a water body,it may p r omote for mati on of M icrocystis bl oom.Key words:DDV;M icrocystis ;alkaline phos phatase;cynaobacterial bl oom基金项目:江苏省社会发展项目(BS2007065)收稿日期:2009-10-22①通讯联系人E 2mail:lijianhong@njnu .edu .cn 农药的大量使用及其残留进入水体必将对水生生态系统产生一定影响,农药对浮游藻类的毒害效应已引起了研究者的注意[1-2],这些研究揭示了高浓度农药的毒害作用。

然而从普遍意义上看,进入水体的农药残留浓度应该是较低的,关于低浓度农药的生态效应已引起了一些学者的关注[3-4]。

磷是导致蓝藻水华暴发的关键营养元素之一,有机磷农药残留进入水体也是地表水体中磷营养的重要来源。

据相关资料显示[5],在较清洁的水源地,有机磷农药残留质量浓度仅在μg ・L -1数量级,但在污染较严重的局部水域,可达几十mg ・L -1。

已有研究发现有机磷农药甲胺磷和辛硫磷对滇池微囊藻生长具有促进作用[6]。

敌敌畏[DDV ,化学名为O,O -二甲基-O (2,2-二氯)乙烯基磷酸酯,C 4H 7Cl 2O 4P ]是一种常见的有机磷农药,具有高效、速效、广谱性等特点,使用范围广,用量也较大,在长期使用过程中,对土壤与水体均会产生不同程度的污染,有关该农药对蓝藻的影响研究尚未见报道。

笔者以2株铜绿微囊藻为对象,研究了常见有机磷农药敌敌畏对微囊藻生长和代谢的影响,旨在揭示农药在蓝藻水华形成中的作用。

1　材料与方法111　试验材料藻种:铜绿微囊藻(M icrocystis aeruginosa )群体株X W 01和单细胞株PCC7806。

农药:质量分数为80%的DDV 乳油,山东高密康丰农化有限公司生产。

112　试验方法11211　藻的预培养无菌条件下将群体株X W 01和单细胞株PCC7806转移至BG11培养液中[7],28℃、3000lx[光]照度、24h 连续光照下,培养至对数生长期时　第3期吴　丽等:农药敌敌畏对铜绿微囊藻生长的影响・265　・用作试验材料。

11212　缺磷培养基的配制将BG11培养基中K 2HP O 4减去,同时添加26113mg ・L-1KCl 以补充K +至原有质量浓度。

11213　DDV 对微囊藻生长的影响试验分别在微囊藻培养液中加入DDV ,使其质量浓度为1、5、10、30、50、100和1000mg ・L -1,在无菌条件下,将处于对数生长期的4mL 藻接入装有40mL 不同质量浓度DDV 的锥形瓶中。

以不加DDV 的处理作为对照,每个处理设3个平行,测定不同质量浓度DDV 对微囊藻生长的影响。

113　藻生长的测定藻浓度采用分光光度计测定波长650nm 时的光吸收值来确定,用丙酮法测定藻液中叶绿素a 浓度[8]。

114　碱性磷酸酶活性的测定采用磷酸苯二钠比色法测定微囊藻胞内、胞外碱性磷酸酶活性[9]。

藻培养物于8000r ・m in -1下离心15m in,取上清液测定酶活性作为胞外酶活性;藻细胞经沉淀后用无菌新鲜培养液洗涤3次,碳酸缓冲液重悬,超声波破碎细胞,于1000r ・m in -1下离心15m in,去除细胞碎片,测定上清液中胞内酶活性。

测得的酶活性除以叶绿素a 浓度得到单位浓度叶绿素a 的碱性磷酸酶活性,以衡量单位藻细胞的酶活性。

2　结果与分析211　不同质量浓度DD V 对2株微囊藻生长的影响由图1可知,不同浓度DDV 对微囊藻的作用不同,在较高浓度下对微囊藻具有明显毒害作用。

ρ(DDV )≥10mg ・L -1时,随着DDV 浓度增加,X W01生长愈加缓慢,叶绿素a 浓度也逐渐减少,ρ(DDV )≥50mg ・L -1时,生长速度和叶绿素a 浓度明显降低。

ρ(DDV )≥10mg ・L -1时,明显抑制单细胞株PCC7806的生长。

然而在较低浓度范围内,DDV 对微囊藻的生长具有一定促进作用,叶绿素a 浓度相对于对照有不同程度的增加。

ρ(DDV )≤5mg ・L -1时,对X W01和PCC7806的生长均有促进作用,尤其在ρ(DDV )为1mg ・L -1时,2株藻的生长速度均明显提高,培养液中叶绿素a 浓度也达到最高,分别为314和419mg ・L -1。

从2株微囊藻对DDV 作用的敏感性来看,群体株对DDV 的抗性更强,显示出群体状态对毒害环境有更强的抵御能力。

ρ(叶绿素a )为微囊藻培养5d 时的测定值。

图1　富磷条件下DDV 对2株铜绿微囊藻生长和叶绿素a 浓度的影响F i g .1　Effects of DD V on growth and chlorophyll 2a con ten t of two M icrocystis st a i n s i n culture m ed i u m r i ch i n phospha te212　正磷酸盐替代DD V 对2株微囊藻生长的影响DDV 是一种含磷化合物,它对微囊藻生长的促进作用是否是因为其提供了更多的磷营养呢?然而在BG11培养液中添加0～51500mg ・L -1K 2HP O 4・266　・生　态　与　农　村　环　境　学　报第26卷(相当于0～50mg ・L -1DDV 中的磷水平)试验结果表明,K 2HP O 4并未对2种微囊藻的生长产生类似的促进作用(图2),说明在已含有丰富磷营养的BG11培养液中,低浓度DDV 的促生长作用并不是由于提供了更多的磷营养所致。

图2　添加K 2HP O 4对2株微囊藻生长的影响F i g .2　Effect of add iti on of K 2HP O 4on growth of two M icrocystis stra i n s213　DD V 对2株微囊藻碱性磷酸酶活性的影响 碱性磷酸酶是参与藻类代谢的重要酶,由图3可知,在一定浓度条件下,DDV 可促进微囊藻碱性磷酸酶的合成,胞内和胞外碱性磷酸酶活性均有不同程度的增长。

对于群体株X W01,ρ(DDV )为1mg ・L -1时,胞外碱性磷酸酶活性明显提高,ρ(DDV )为10mg ・L -1时,胞内酶活性也有所增加;对于单细胞株PCC7806,ρ(DDV )为1mg ・L -1时,胞内、外碱性磷酸酶活性均有所提高。

该结果显示,低浓度DDV 对微囊藻的生理代谢过程具有一定的调节作用。

环境中有机磷的存在可能对碱性磷酸酶的合成具有一定的诱导作用。

微囊藻培养5d 时的测定值。

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农药对藻类的生态毒理学研究_毒性机理及其富集和降解

农药对藻类的生态毒理学研究_毒性机理及其富集和降解

第7卷第6期1999年12月 环境科学进展ADVANCES IN ENV IRONM EN TAL SCIENCE Vol.7,No.6Dec.,1999农药对藻类的生态毒理学研究Ⅱ:毒性机理及其富集和降解Ξ沈国兴　严国安　彭金良　严雪(武汉大学环境科学系,武汉430072)摘　要随着对农药污染认识的深入,农药对生态系统的初级生产者———藻类毒性以及毒性机制的研究不断增多。

农药对藻类的毒性在于破坏藻类生物膜的结构和功能、影响藻类的光合作用、改变呼吸作用以及固氮作用,影响藻类的生理进程并改变其生化组分。

开展农药对藻类毒性机理的研究,揭示农药结构—活性关系,对农药的研制和应用,评价农药的生态风险,减少农药对藻类的毒害是重要的。

在自然环境中还发现藻能富集和降解农药。

因此,对于这些藻来说,农药对藻类的毒害作用和藻类对农药的富集和降解作用可能同时存在。

本文综述了农药对藻类的毒性机理以及藻类对农药的富集和降解作用。

关键词:农药　藻类　毒性机理　富集　降解一、前 言在日常施用农药的过程中,只有大约1%作用于靶生物,其余的或残留于土壤,或通过径流进入水域,影响土壤和水体中的生物。

过去大量的报道见于农药对鸟类、无脊椎动物、鱼类、哺乳动物的影响及其毒理学研究,对毒性机理的研究更集中于靶生物和哺乳动物。

现在已经知道,有机磷和甲基氨基甲酸酯类杀虫剂抑制动物神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性,其中有些杀虫剂还与植物细胞脂膜上的一些活性位点发生作用;拟除虫菊酯类、甲基氨基甲酸酯类和另外一些杀虫剂抑制微体多功能氧化酶系统,这些酶能催化以有毒物质为底物的反应,是重要的解毒酶[1]。

一般认为除草剂作用于质体的Hill反应、线粒体的电子传递和光合作用,脂溶性除草剂作用于生物膜[2]。

近年来,随着农药对藻类毒性效应研究的重视,农药对藻类致毒机理的研究逐渐深入。

农药对藻类的毒性因农药品种和藻类的不同而不同,机理较为复杂。

从分子水平了解农药对藻类毒性机理,对于评价农药的生态风险,开发低生态风险的农药具有重要意义。

低浓度有机磷农药DDV对微囊藻生长的影响

低浓度有机磷农药DDV对微囊藻生长的影响

探讨有机磷和无机磷对微囊藻生长的影响吴丽(藻类工程和显微镜实验室/南京师范大学生命科学学院,江苏南京) 本文主要以DDV和K2HPO4 为例,研究了以有机磷或无机磷为磷源时,铜绿微囊藻的生长过程。

在实验室内利用BG-11（含磷量为5.4 mg·L–1，磷源为K2HPO4）培养液培养,通过测定藻吸光值和叶绿素a含量,研究不同浓度下有机磷农药DDV 和无机磷酸盐K2HPO4对群体M. aeruginosa XW01和单细胞M. aeruginosa 7806生长的影响,探究2种藻对有机磷和无机磷利用差异与特点。

结果表明,DDV浓度在1.00 mg·L–1时，其对群体微囊藻和单细胞微囊藻都有一定的促进作用。

相对于K2HPO4，DDV含磷较低的浓度下就能够促进微囊藻的生长。

当DDV浓度在1.00～1000.00mg·L–1浓度范围内，DDV对群体M. aeruginosa XW01的生长表现出低浓度刺激、高浓度抑制的效应, 并且当DDV浓度在0.01～100.00mg·L–1质量浓度范围内, 单细胞M. aeruginosa 7806也出现此效应。

而对于有机磷K2HPO4来说，当其含磷量在0.011～11.00 mg·L–1范围内时，无论是单细胞微囊藻还是多细胞微囊藻均表现出一定程度的低浓度刺激、高浓度抑制的效应，但不是很明显。

相较于有机磷农药DDV，无机磷酸盐K2HPO4在高浓度范围下不会对藻生长产生严重的抑制作用。

关键词: 有机磷；无机磷;群体微囊藻;单细胞微囊藻;碱性磷酸酶在我国大部分富营养化水体中,铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa) 在数量和发生频率上均占优势[1 —2 ] ,铜绿微囊藻死亡或细胞膜通透性增强时会向水中释放微囊藻毒素,对环境和人类健康造成危害. 因此国内外研究者围绕铜绿微囊藻做了大量工作[3 —5 ] . 关于造成湖泊富营养化的营养物质基础问题,一致的观点认为主要物质是氮和磷[6-8],其中磷的限制作用又大于氮[9 —11] .在自然状态下,水体中的磷以多种形态存在，其中以可溶性有机磷(DOP) 和悬浮态磷为主,而生物可直接利用的可溶性无机磷的含量很低[12 ] .因此微囊藻对水体中有机磷利用的问题引起笔者的注意。

不同盐度下敌敌畏对海水小球藻的毒性效应

不同盐度下敌敌畏对海水小球藻的毒性效应

第44卷　增刊厦门大学学报(自然科学版)Vol.44　Sup.　2005年6月Journal of Xiamen University (Nat ural Science )J un.2005　不同盐度下敌敌畏对海水小球藻的毒性效应收稿日期:2005203210基金项目:福建省海洋与渔业局专项基金及博士后基金资助作者简介:齐安翔(1980-),男,硕士研究生.3通讯作者:mgcai @齐安翔1,蔡明刚1,23,黄天春1,刘四光1,王杉霖1(1.厦门大学海洋系,2.厦门大学亚热带海洋研究所,福建厦门361005)摘要:本文对不同盐度下敌敌畏对海水小球藻的毒性效应进行了研究.结果表明,EC 50(48h )或EC 50(72h )可作为准确评价敌敌畏毒性效应的指标.盐度作为环境因子可较显著影响敌敌畏对微藻的毒性效应.在低农药浓度下,高盐海水中的小球藻可表现出一定的"毒物兴奋效应",但在低盐条件下则无此效应.在高农药浓度下,随着盐度变化,敌敌畏对海水小球藻的毒性效应呈现3种不同的情况.关键词:有机磷农药;敌敌畏;盐度;海水小球藻;毒性效应中图分类号:Q 948 文献标识码:A 文章编号:043820479(2005)Sup 20215204 有机磷农药是一种应用很广的农用杀虫剂.然而,在目前技术水平条件下,农药利用率仅为20%,而80%或更多的农药在施用后进入环境中,形成一个颇大的非点源污染[1].大量施用的有机磷农药通过河流、大气及地下水携带入海,对沿岸海域造成一定的污染,是近岸海域的主要污染物之一.海洋微藻在海洋生态系统的食物链中起着十分重要的作用.藻类由于其对毒物敏感、易获得、个体小、繁殖快,在较短时间内可得到化学物质对藻类许多世代及种群水平的影响评价,已成为一种很好的测试生物[2].国外在化学品风险测试中选用藻类进行生物测试,并已建立多个藻类生物测试标准方法[3].我国已开展一系列有机磷农药对海洋微型藻类致毒效应的研究[4～6].有机磷农药对生物影响不仅取决于污染物的浓度,同时还受到温度、营养盐等环境因子的影响[4].沿岸海域盐度变化较大,这可能改变有机磷农药降解条件,进而影响其对海洋微藻的致毒机制,并对海洋初级生产力产生影响.目前,有关该方面的研究报道较少见[5].本文选择目前海水养殖业的通用饵料生物海水小球藻(Marine Chlorell a ),开展了不同盐度下敌敌畏对其的毒性效应研究.1　材料与方法1.1　实验藻种实验选用的海水小球藻(Marine Chlorell a )由本系海洋有机化学组微藻培养室提供.1.2　藻种的培养与实验条件实验用消毒海水配制f/2培养基.25.0℃下无菌接种,光照强度为2500～3500lx ,光暗比为14:10,接种密度4.5×106个/mL.实验设置5个不同盐度梯度(分别为10,15,20,25,30),每个盐度下设置7个农药浓度组(0.2,0.5,2,5,10,20,40mg/L )和一个空白组,每组两个平行样.一次性培养96h ,在实验中24,48,72,96h 分别取样,用血球计数板进行细胞密度测定.参考指标为生长速率(k )和半有效浓度(EC 50).实验中使用的有机磷农药为敌敌畏(80%乳油,浙江巨化股份有限公司兰溪农药厂生产),现用现配.2　结果与讨论2.1　敌敌畏毒性效应指标(EC 50)培养时间的选择图1为不同盐度下敌敌畏对海水小球藻相对增长率影响的关系图,4条曲线分别表示为24、48、72和96h 小球藻生长对有机磷农药的响应.可以看出,不同培养时间的观测结果差别较大.在实验开始的24h 内,不同盐度条件下海水小球藻相对增长率均随农药变化趋势波动较大,未呈现出明显的规律性.当盐度为20,海水小球藻相对增长率在24h 内基本不受农药浓度变化的影响;而盐度为30,却出现了异常的大幅上升.这可能是因实验初期农药与瓶壁吸附,毒性下降等因素有关,也可能与藻体繁殖过快而自身生物稀释有关[7].汝少国等[7]开展了有机磷农药对扁藻的毒性效应研究,发现EC 50(24h )和EC 50(96h )值会偏低或偏高.　图1　不同盐度下敌敌畏对海水小球藻相对增长率的影响　Fig.1　Effects of Dichlorvos on the relative growth rate of the Marine Chlorella at different salinities研究发现,在48和72h ,不同盐度条件下海水小球藻相对增长率随农药变化趋势较为一致(图1),这说明,海洋微藻对环境改变的适应需要一定的时间.因此,在评价指标EC 50培养时间的选择上,24h 可能太短,难以反映真实情况,而选择48h 或72h 的EC 50值较为客观.2.2　盐度对敌敌畏毒性效应的影响2.2.1较低敌敌畏浓度下盐度对毒性效应的影响在较低的有机磷农药污染条件下,不同盐度对海水小球藻生长的影响略有不同.由图3a 可以看出,小球藻比增长率随盐度变化呈现波动变化.24h 时小球藻比增长率随盐度变化呈上升趋势,但在盐度为15和25时略有下降;48h 时,盐度10到20之间小球藻比增长率随盐度变化呈上升趋势,当盐度为20时达到最大值,随后下降;72h 和96h 时,盐度为20和30时小球藻比增长率较高,在盐度为15和25时小球藻比增长率偏低.由此可见,在盐度较高的情况下(S >15),海水小球藻会表现出一定的"毒物兴奋效应",最大刺激效应的对应农药浓度为5mg/L (图2).分析认为,敌敌畏对藻类生长有一定的抑制作用,但由于该农药中含磷,为藻类生长提供了营养元素,因此,在较短的作用时间内,抑制作用消失后,反而对藻类生长有促进作用[8].2.2.2较高敌敌畏浓度下盐度对毒性效应的影响　图2　72h 时不同盐度下敌敌畏对海水小球藻相对增长率的影响　Fig.2　Effects of organic phosphorus pesticide on therelative growth rate of the Marine Chlorella at different salinities at 72h在较高浓度敌敌畏(>5mg/L )环境下,小球藻比增长率随盐度变化趋势与低浓度敌敌畏条件下基本一致,但比增长率明显降低(图3b ).可见海水小球藻的生长受到严重抑制,其增长率不仅低于对照组,而且随着农药浓度的提高,相对增长率逐渐降低.我们选择各盐度下的72h 关系曲线作为比较(图2),并根据K 值,用图解内插计算出各盐度下不同培养时间的半抑制浓度EC 50(表1).可以看出,盐度为20和30时均属・612・厦门大学学报(自然科学版) 2005年　图3　不同敌敌畏浓度下盐度对海水小球藻相对增长率的影响　Fig.3　Effects of salinities on the relative growth rate of the Marine Chlorella at different concentration of Dichlorvos表1　不同盐度下敌敌畏对海水小球藻EC50　Tab.1　EC50of Dichlorovos on the Marine Chlorella atdifferent salinities盐度SEC50/mg・L-148h72h96h107.51 5.011510.019.9912.512025.1226.7939.42515.028.889.95309.0915.5313.27于低毒范围;低盐度和盐度为25时,敌敌畏对海水小球藻为中等毒性,其中盐度为10时EC50(72h)值最小,毒性最强.通过对表1中不同盐度下敌敌畏对海水小球藻的EC50分析,可将盐度对有机磷毒性的影响分为以下3种情况:(1)盐度S=15和20时,随培养时间的延长,农药对小球藻的EC50呈增加趋势.王翠红等[9]的甲胺磷对小球藻的毒性效应实验,EC50呈现相同的变化趋势.因为在较高浓度有机污染物存在之初,藻类的生长受到明显的抑制,但随着时间的延长,有机污染物的毒性降低,生长情况恢复正常,所以EC50值呈增加趋势[10].另外,EC50值呈增加趋势,可能还与因藻体繁殖快而自身生物稀释有关.随着时间的延长农药毒性降低的原因,可能有以下几种:1)农药的生物降解;2)农药的自动降解;3)生物适应;4)进入细胞的农药减少[11].邹立等[5]的研究也证明了敌敌畏在盐度为20时对亚心形扁藻的EC50值要明显大于盐度为30时的EC50值.因此,可以推测盐度20时EC50值的增加是由于敌敌畏降解速率加快造成的.(2)盐度S=25时,随处理时间的延长,农药对海水小球藻的EC50呈下降趋势.这是由于高浓度有机污染物对藻类细胞的生长产生不可逆的破坏作用,破坏了藻类的细胞膜,使细胞膜的透性增加,环境中的有毒物质能顺利进入细胞,与某些生命活性物质发生反应,加大了对藻类的毒害,随着时间的延长,毒性增大[10].(3)盐度S=30时,随处理时间的延长,农药对海水小球藻的EC50呈先上升后下降的趋势.王翠红等[9]作的对硫磷、敌敌畏、水胺硫磷等多种农药对小球藻的毒性效应也得到相似结果.这可能是由于毒物作用时间延长,藻细胞分裂速度减慢,死亡速度增加,导致EC50值降低;也可能由于培养时间的延长,而在此期间又不添加营养物,导致营养的缺乏或其他理化条件的改变,进而藻细胞数减少,EC50值下降[10].3　结　语本文就不同盐度下农药敌敌畏对海洋微藻的致毒效应进行了初步研究,结果表明:(1)培养初期海水小球藻相对增长率随敌敌畏浓度变化趋势不甚明显,而在培养后期(72h)较为稳定,建议进行致毒效应评价时,采用48h或72h;(2)在较高盐度下(S>10),敌敌畏低浓度(≤5mg/L)时,海水小球藻可维持80%以上的相对增长率,并且随时间的延长,增长率继续上升.可见较高盐下,低浓度的敌敌畏可对微藻的增长起促进作用;(3)研究发现,较高敌敌畏浓度下盐度对毒性效应的影响可分为3类:1)盐度S=15和20时,随处理时间的延长,敌敌畏对小球藻的EC50呈增加趋势;2)盐度S=25时,随处理时间的延长,农药对海水小球藻・712・增刊 齐安翔等:不同盐度下敌敌畏对海水小球藻的毒性效应的EC 50呈下降趋势;3)盐度S =30时,随处理时间的延长,农药对海水小球藻的EC 50呈先上升后下降的趋势.致谢:海洋与环境学院实验教学中心的刘瑞华和张朝霞等老师在为本实验提供了诸多方便,特此致谢.参考文献:[1]　郑天凌,鄢庆枇,林良牧,等.海洋微生物对甲胺磷农药的降解作用[J ].台湾海峡,1999,18(1):95-99.[2]　高玉荣.杀虫剂单甲脒对绿藻的毒性研究[J ].环境科学学报,1995,15(1):92-97.[3]　Caux Pierre 2Yves ,Menard L ucie ,Kent Pobert A ,et al.Comparative study of the effects of MCPA ,butylate ,at 2razine ,and cyanazine on selenastrum capricornutum [J ].Environmental Pollution ,1996,92(2):219-225.[4]　谢荣,唐学玺,李永祺.有机磷农药和重金属对海洋微藻的联合毒性研究[J 海洋环境科学,1999,18(2):16-19.[5]　邹立,程刚,李永祺,等.11种有机磷农药对海洋微藻致毒效应的研究[J ].海洋环境科学,1998,17(3):29-34.[6]　唐学玺,李永祺.对硫磷对三角褐指藻核酸和蛋白质合成动态的影响[J ].生态学报,2000,20(4):598-600.[7]　汝少国,李永祺,敬永畅.十种有机磷农药对扁藻的毒性[J ].环境科学学报,1996,16(3):337-341.[8]　周常义,池信才,黄成,等.三唑磷对四种水生生物的毒性及安全评价研究[J ].台湾海峡,2003,22(3):319-324.[9]　王翠红,徐建红,辛晓芸,等.六种有机磷农药及三种重金属离子对小球藻的毒性研究[J ].河南科学,1999,17:529-535.[10]　沈宏,周培疆.环境有机污染物对藻类生长作用的研究进展[J ].水生生物学报,2002,26(5):108-110.[11]　Mohapatra Mohanty.Growth pattern changes of Chlo 2rella vulgaris and Anabaena doliolum due 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pesticide ;dichlorvos ;salinity ;MarineChlorella ;toxicity・812・厦门大学学报(自然科学版) 2005年。

利用铜绿微囊藻荧光检测农药莠去津的生物毒性

利用铜绿微囊藻荧光检测农药莠去津的生物毒性

河北工业大学学报JOURNAL OF HEBEI UNIVERSITY OF TECHNOLOGY第42卷第3期V ol.42No.32013年6月June 2013文章编号：1007-2373(2013)03-0038-05利用铜绿微囊藻荧光检测农药莠去津的生物毒性田宝勇1，徐小惠2，程玉欣2，崔建升2（1.河北科技大学河北省分析测试研究中心，河北石家庄050018；2.河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄050018）摘要建立利用铜绿微囊藻叶绿素荧光技术检测农药莠去津生物毒性的新方法．通过实验确定了铜绿微囊藻制备方法和条件，得到其叶绿素荧光的激发波长、荧光波长分别为435nm 和680nm ，在该波长处铜绿微囊藻荧光对莠去津有灵敏响应，莠去津的质量浓度与藻荧光信号抑制率呈明显的正相关性，相关系数为r =0.9953，线性范围为0.002~0.064mg/L ．叶绿素荧光检测方法与标准发光细菌法无显著性差异，可用于莠去津生物毒性检测．关键词铜绿微囊藻；生物毒性；农药；莠去津；叶绿素荧光中图分类号X832文献标志码AThe use of Microcystis aeruginosa chlorophyll fluorescence to testthe biological toxicity of the pesticide atrazineTIAN Bao-yong 1，XU Xiao-hui 2，CHENG Y u-xin 2，CUI Jian-sheng 2(1.Hebei Analys is and Testing Research Center,Hebei Un iversity of Science and Techn o logy ,Hebei Shijiazhuang 050018,China;2.School of Environmen tal Science and Engineering,Hebei Un iv ers ity of Science and Tech nology ,Hebei Sh ijiazhuang 050018,China )Abstra ct A new method for the determination of the pesticide atrazine biological toxicity by Microcystis aeruginosachlorophyll fluorescence technology was established.The experiment determined preparation methods and conditions of Microc ystis aeruginosa,and 435nm/680nm as the chlorophyll fluor escence excitation and emission wavelengths.In the wavelength,the e ffect of atrazine on algae fluorescence is extraordinar y ,even the concentration of atrazine and in-hibition rate of algal photosynthetic signa l has a significant positive correlation,r=0.9953,and the linear range of atrazine was 0.002~0.064mg/L.The test method of chlorophyll fluorescence has no significant difference with lumine scent bac-teria method,which ca n be used for atraz ine biological toxicity test.Key wor dsMicrocystis aeruginosa;biological toxicity;pesticide;atrazine;chlorophyll fluorescenceKautsky 在1931年首先用肉眼发现了叶绿素荧光现象[1]，之后逐步发展形成叶绿素荧光理论，即当生物体受到外界环境因子刺激时，其光合作用会受到抑制，引起光合速率降低，致使荧光产量增加．叶绿素荧光理论和技术发展很快，已在植物生理、生态毒理、基因工程等方面得到了广泛的应用．Schreiber 在1983年利用饱和脉冲法发明了世界上第一台脉冲振幅调制（P AM ）叶绿素荧光仪，后来陆续有人将其应用于检测水中农药含量．Conrad 等在1993年利用PAM-100叶绿素荧光仪测量可变荧光的方法研究了用单胞藻检测农药含量的可行性，其检测限为100g/L[2]．Trapmann 等在1998年利用PAM-2000便携式叶绿素荧光仪，测量类囊体（Thylakoids ）的量子产量的方法，对饮用水进行了农药残留的检测，对敌草隆（Diuron ）的检测限为0.4g/L [3]．Schreiber 在2001年又发明了一种用于检测水中毒性物质的ToxY-PAM ，测量单胞藻的荧光强度的变化判定水中毒性物质的综合毒性[4]．王丽等在2008年利用ToxY-PAM 双通道脉冲振幅调制叶绿素荧光仪测量三角褐指藻的荧光强度的方法，对敌草隆和莠去津进行检测，检出限分别为0.1g/L 和0.5g/L[5-6]．本研究选用水环境中常见的且会在温暖的季节大量生长形成水华的铜绿微囊藻为测试对象，利用F-7000荧光光谱仪测量铜绿微囊藻叶绿素荧光强度的变化来研究除草剂莠去津对藻的影响规律，建立莠去津荧光检测方法．收稿日期：33基金项目：国家高技术研究发展计划（63计划）（）作者简介：田宝勇（6），男（汉族），副研究员．201-0-1182007AA092201198-39田宝勇，等：利用铜绿微囊藻荧光检测农药莠去津的生物毒性第3期1材料与方法1.1生物材料1.1.1藻种及藻种的培养本实验所用铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa 藻种购于中国科学院武汉水生生物研究所．实验采用BG-11培养基，于无菌条件下将藻种转移至装有100mL 培养基的三角瓶中，置于恒温光照培养箱中培养．所用培养基和器皿均需高温灭菌消毒．培养条件是：光照度为2000~2500lux ，温度为25±1℃，湿度为75%RH ，光暗周期为12h ∶12h ，静置培养．每日摇瓶2~3次，每次随机调换三角瓶的位置，以免引起光照不均．将生长至对数期的藻种按比例转接到灭菌培养基中，如此反复转接3次以上，使藻种达到同步生长．然后对该藻进行扩大培养，培养10d 后测量铜绿微囊藻在680nm [7]处的OD 值，在藻液OD 值达到1.00时用于实验．1.1.2发光细菌明亮发光杆菌为海洋菌，菌种为冻干粉，购于美国哈希公司．1.2仪器与试剂日立F-7000荧光光谱仪，荧光光谱仪工作参数：狭缝为5nm ，扫描速度2400nm/min ，激发波长400~500nm ，发射波长600~700nm ，步长5nm ，电压700V ，1cm 的标准四通石英比色皿；722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；RGX-250型人工气候箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；Eclox 生物毒性快速检测仪（美国哈希公司）．38%莠去津悬乳剂为山东乐邦化学品有限公司生产．实验设定莠去津的质量浓度分别为0.002mg/L 、0.008mg/L 、0.016mg/L 、0.032mg/L 、0.048mg/L 和0.064mg/L ．1.3测定方法1.3.1检测藻液浓度与光密度关系测定使用722型可见分光光度计，测定稀释至不同浓度的铜绿微囊藻在680nm 处的吸光度（OD 值），绘制关系曲线．1.3.2叶绿素荧光参数测定使用F-7000荧光光谱仪进行藻叶绿素荧光参数的测定，先对铜绿微囊藻进行三维荧光光谱分析，初步确定藻的激发波长与发射波长[8]，然后进行荧光激发光谱和荧光发射光谱扫描，对比光谱图，确定铜绿微囊藻叶绿素荧光的最佳激发波长（）与发射波长（），然后在/波长下测定加入莠去津溶液前后铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度，按公式(1)计算光合抑制率光和抑制率=×100%(1)式中：0为空白叶绿素荧光强度；为样品叶绿素荧光强度．1.3.3发光细菌发光量的测定按照《水质急性毒性的测定发光细菌法》[9]的方法，用Eclox 生物毒性快速检测仪进行发光细菌发光强度的测定．按公式(2)计算发光细菌的发光抑制率发光抑制率=×100%(2)式中：为空白发光强度；为样品发光强度．2结果与讨论2.1铜绿微囊藻叶绿素荧光特征参数的确定叶绿素荧光主要由构成光合作用系统Ⅱ（PS Ⅱ）的叶绿素a 产生[10]．活体藻液中叶绿素a 的激发与发射波长为356[11-14]，而不同介质中的叶绿素具有不同的荧光光谱[15]，即不同种类的藻的叶绿素最佳激发波长与发射波长略有不同．铜绿微囊藻的三维图谱见图，横坐标为发射波长（波长范围5~），4nm/84nm a 140720nm40河北工业大学学报第42卷纵坐标为激发波长（波长范围450~750nm ），图中的曲线为荧光强度等高线．由图可以看出有一中心即为最高峰，是藻蓝蛋白发出的荧光（/=620nm/650nm ）．对铜绿微囊藻在激发波长为435nm 处进行荧光光谱扫描，获得铜绿微囊藻荧光光谱图（图2）．由图可知，铜绿微囊藻在680nm 处有一峰，对应荧光强度最大；在660nm 前有一个相对平缓的峰，对应的是铜绿微囊藻的藻蓝蛋白．最终确定铜绿微囊藻叶绿素荧光的最佳/为435nm/680nm ．铜绿微囊藻藻液浓度可以用OD 值表示．图3表示稀释不同倍数的铜绿微囊藻与光密度的关系，很显然，随藻液稀释倍数的增大OD值不断减小，回归方程=1.20620.9441，相关系数=0.9998．图4表稀释不同倍数的铜绿微囊藻的OD 值与其对应叶绿素荧光强度之间的关系，即藻液的浓度与叶绿素荧光强度的关系．图中显示藻液的荧光强度随OD 值的增大而增强，但OD 值大于0.80后荧光强度不再随藻液OD 值的增大而增强，趋于平稳．OD 值为0~0.74范围内，铜绿微囊藻的OD 值与荧光强度呈正相关关系，r =0.9889，y =0.5942+9.8148x ，说明在一定浓度范围内，可以用叶绿素荧光技术来测定铜绿微囊藻的浓度[16]，可以用叶绿素荧光强度来表示藻液浓度．本实验选用OD 值为0.400的铜绿微囊藻作为实验用藻浓度，用灭菌的蒸馏水稀释制备检测藻液．2.2铜绿微囊藻荧光对莠去津毒性的响应时间实验莠去津溶液与藻液按1∶100比例充分混合反应，每3min 测定一次铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度．结果表明，莠去津溶液对藻的光合信号抑制作用随时间不同．由图5可以很清楚看出，0~10m in 内叶绿素荧光强度随时间而明显增大，说明在此时间内，莠去津对藻产生影响，抑制了光合作用使荧光迅速增大；~内图1铜绿微囊藻的三维荧光谱图Fig.1Three dimensional excitation-emissio n matrices ofMicrocy s tis aeruginosa图2铜绿微囊藻的荧光发射光谱Fig.2Flu ores cence emis sion spectra of Microcys tis aerug inosa720450550750发射波长/n m激发波长/n m600620640660680700发射波长/nm1086420荧光强度680图4不同浓度铜绿微囊藻的OD 值与荧光强度的关系Fig.4The relation s hip between the o p tical den s ity of M icro-cystis aerugin os a an d fluorescence in tensity0.00.20.40.60.81.01.2铜绿微囊藻在680nm 的OD 值1086420叶绿素荧荧光强度=0.5942+9.8148=0.9889图3稀释不同倍数的铜绿微囊藻与其对应的光密度的关系Fig.3Th e relationship between different dilution multip les of Micro-cystis aeruginosa and its optical density246810铜绿微囊藻稀释倍数1.21.00.80.60.40.20O D值=1.20620.9441=0.99981020min41田宝勇，等：利用铜绿微囊藻荧光检测农药莠去津的生物毒性第3期荧光变化趋于平稳，信号稳定，藻已经适应了莠去津的毒性．本实验选15min 作为铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津的响应时间．2.3莠去津浓度与荧光强度剂量-效应关系实验取100L 的莠去津标准液至10mL 铜绿微囊藻，使其充分反应15min ，测定铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度．每一浓度设置3个平行样．设置一组空白样，其中加入100L 灭菌的蒸馏水．由图6可知，藻光合作用的受到不同程度的抑制，且抑制程度与莠去津的浓度呈正相关，显示明显的浓度-剂量相关性，半数抑制浓度(IC 50)为0.030mg/L ．在浓度为0.002~0.064mg /L 内，光合抑制率与莠去津浓度成明显的线性关系，计算得回归方程为y =0.034+15.466x ，r =0.9953．该曲线作为铜绿微囊藻荧光法定量测定莠去津的标准曲线．2.4样品的测定及与发光细菌方法的比对用铜绿微囊藻叶绿素荧光方法与发光细菌法同时测定不同浓度的莠去津溶液，每一浓度设置3个平行样，实验结果见表1．表1不同浓度莠去津的荧光法与发光细菌法测定Tab.1Determination of different c oncentrations of atrazine in photobacteriame thod and fluoresce nce method莠去津质量浓度/mg L 1)藻类荧光法光合抑制率/%发光细菌标准法发光抑制率/%0.002 6.79 4.120.00812.91 6.960.01631.8016.730.03257.0938.060.04880.3748.850.06497.669.31由表1知，莠去津浓度与发光抑制率正相关，回归方程y =0.024+10.883x ，相关系数为r =0.9962．经t 检验求得|t|=0.895，给定=0.05，由t 界值表查得t 0.05(5)=2.57，|t|=0.895<2.57=t 0.05(5)，>0.05，说明叶绿素荧光法与发光细菌法测定莠去津毒性结果无显著性差异，证明可以用铜绿微囊藻叶绿素荧光检测方法替代发光细菌法测定农药莠去津的生物毒性．发光细菌法测定莠去津的半抑制浓度(IC 50)为0.046mg/L ，测定的浓度范围大于铜绿微囊藻叶绿素荧光方法．又取某农场莠去津喷雾器清洗废水样品3个，分别用藻类荧光法和标准发光细菌法测定他们的生物毒性，每个样品平行测定3次取平均值，实验结果见表2．经计算，两种方法测得的实际样品中莠去津的含量见表3．对测定的结果进行检验，得||=，给定=5，由界值表查得5()=33，||=<33=5()，>5，说明利用铜绿微囊藻叶绿素图5莠去津对铜绿微囊藻叶绿素荧光的影响随时间的变化Fig .5Effects o f Microcystis aeruginosa chlorophyll fluor-escence respongding on atrazine with time图6莠去津浓度与光合作用抑制率的剂量-效应关系Fig.6The dose-effect relationship of atrazine concentrationand photosynthesis inhibition rate510152025/min181********6叶绿素荧荧光强度0.000.020.040.06莠去津质量浓度/mg L1100806040200光合抑制率/%=0.034+15.466=0.9953t t 0.2790.0t t 0.02 4.0t 0.279 4.0t 0.02P 0.042河北工业大学学报第42卷荧光法和发光细菌法进行的实际水样测定结果无显著性差异，且两测定结果的比值相近，证明可以用铜绿微囊藻叶绿素荧光检测方法替代发光细菌法测定农药莠去津的生物毒性．表2荧光法与发光细菌法测定实际样品结果比较Tab.2A comparison of mea surement results in photobacteria method and fluore scence method样品序号藻类荧光法光合抑制率/%发光细菌标准法发光抑制率/%合抑制率与发光抑制率比值13522 1.5924833 1.4536241 1.52表3荧光法与发光细菌法测定实际样品莠去津含量的比较Tab.3A comparison of atrazine concentration in photobacteria method and fluorescence method样品序号藻类荧光法测定莠去津含量/mg L1)发光细菌法测定莠去津含量/mg L1)2种方法测定结果比值10.0200.018 1.11120.0290.028 1.03630.0380.035 1.0863结论1）铜绿微囊藻叶绿素荧光的最佳激发和发射波长为435/680nm，检测藻液浓度OD680nm为0.400，铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津毒性的最佳响应时间为15min．2）铜绿微囊藻光合抑制率与莠去津质量浓度成明显的线性关系，回归方程为y=0.034+15.467x，r=0.995 3，线性范围为0.002~0.064mg/L，半数抑制浓度（IC50）为0.030mg/L．3）发光细菌法测定莠去津含量的标准曲线为y=0.024+10.883x．实际样品中莠去津含量的铜绿微囊藻荧光测定及与发光细菌标准法的比对结果显示，|t|=0.279<4.303=t0.05(2)，P>0.05，铜绿微囊藻叶绿素荧光检测方法可以替代发光细菌法测定农药莠去津的生物毒性．参考文献：[1]Govindjee．Sixty-three y ears since kautsky：Chlorophyll a fluorescen ce[J]．Australia Jou rnal of Plant Physiology，1995，22：131-160．[2]Conrad R，Büchel C，Wilhelm C，et al．Chan g es in y ield of in-vivo fluorescence of chlo rophyll a as a too l for selective herbicide mon itoring[J]．J Appl Ph 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