微生物鉴定 细菌 霉菌计数

微生物检验实验室细菌鉴定操作规程

1．目的

规范细菌鉴定标准操作规程。

2．适用范围

革兰阴性菌、革兰阳性菌等。

3．职责

检验人员严格执行本程序。

4．程序

4.1 观察菌落大小、颜色、气味、溶血、形态特征等，观察内容应记录在《细菌鉴定流程表》。

4.2 涂片，革兰染色，观察染色性及细菌形态、大小和排列，球菌、杆菌或螺形菌等，观察内容记录在《细菌鉴定流程表》。

4.3 初步生化反应根据菌落特征和涂片结果选择初步生化反应，如氧化酶、触酶、凝固酶（玻片法）等。

4.4 制定细菌鉴定方案

4.4.1 仪器鉴定方案（以VITEK2为例）

革兰阴性杆菌：选择GN卡（阴性菌鉴定卡）。

革兰阳性球菌：选择GP卡（阳性菌鉴定卡）。 酵母菌：选择YST卡（酵母菌鉴定卡）。

需氧芽孢杆菌：选择BBL卡（需氧芽孢杆菌卡）。

4.4.2 手工细菌鉴定法

氧化酶阳性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合：葡萄糖O/F、木糖、麦芽糖、硝酸盐、动力、七叶苷等生化反应。

氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择肠杆菌科细菌鉴定生化反应组合：触酶、硝酸盐、葡萄糖O/F、动力、乳糖、VP、吲哚、甲基红、枸橼酸盐、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸等生化反应。

疑不动杆菌氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合。

革兰阳性球菌，选择革兰阳性球菌鉴定生化反应组合：触酶、葡萄糖O/F、胆汁七叶苷、蔗糖、木糖、甘露醇、硝酸盐、脲酶等。

山东科学　ＳＨＡＮＤＯＮＧ　ＳＣＩＥＮＣＥ　第２７卷第３期２０１４年６月出版　ＶＯＩ．２７　ＮＯ．３　ＪＵｎ．２０１４　

ＤＯＩ：１０．３９７６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—４０２６．２０１４．０３．００５　农业微生物专栏，－ｃ　

辣椒疫霉菌拮抗细菌的筛选、鉴定及防效测定　

孙冰冰　，段红英　，李伟　，魏军　，田涛　

（１．天津市农业科学院植物保护研究所，天津３００３８１；２．天津市西青区植物保护站，天津３００３８０）　

摘要：从天津、河北、山东、山西、福建、河南及江苏等地蔬菜根际土壤中分离细菌１万余株，从中筛选出对辣椒疫霉菌　

Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｃａｐｓｉｃｉ有明显拮抗作用的细菌８０２株，进一步用立枯丝核菌Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ、番茄灰霉菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ及　瓜果腐霉菌Ｐｙｔｈｉｕｍ　ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ为靶标筛选出对以上病原真菌有较好拮抗作用的菌株６２株。对辣椒疫病防效温室　盆栽实验结果表明，６个菌株防效在７０％以上，其中茵株ＴＢ１３４０防效最高，达到８２％。菌株ＴＢ１３４０生物学特性测定结　

果表明其具有较强的产生几丁质酶、纤维素酶和１３．１，３－葡聚糖酶活性。经１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列分子鉴定结合形态学观　

察，菌株ＴＢ１３４０被初步鉴定为芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．。　关键词：辣椒疫霉；拮抗细菌；筛选；防治效果　中图分类号：￥４３２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２－４０２６（２０１４）０３－００２３－０７　

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　

ｏｆ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｃａｐｓｉｃｉ　

ＳＵＮ　Ｂｉｎｇ－ｂｉｎｇ　，ＤＵＡＮ　Ｈｏｎｇ—ｙｉｎｇ　，ＬＩ　Ｗｅｉ　，ＷＥＩ　Ｊｕｎ　，ＴＩＡＮ　Ｔａｏ　

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００３８１，Ｃｈｉｎａ　２．Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｘｉｑｉｎｇ　Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００３８０，Ｃｈｉｎａ）　

微生物总数检测方法（真菌）

一、检测用培养基配方与培养条件

1. 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA培养基）

配制：以北京路桥PDA培养基为例，按说明上配制需称取培养基4克，加水100毫升。

2. 培养条件：25℃-30℃；时间：72-96小时。

二、检测与计数方法

1. 梯度稀释

称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂3—5滴，分散剂可以是吐温，OP—80，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后，上旋转式摇床200 r/min充分振荡60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。

2. 用10mL无菌移液管分别吸取10mL上述母液菌悬液加入90 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管，每一个稀释度瓶种应放有适量的玻璃珠，以保证菌液分布均匀）。

3. 加样及培养

取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。

4. 菌落识别

根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。

5. 菌落计数

以出现20—70个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。

有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数：

nm = xkv1/(m0v2) ×10-8 或 nv = xkv1/(v0v2) ×10-8 （1）

式中：

nm — 质量有效活菌数， 亿/g

nv — 体积有效活菌数， 亿/mL

x— 有效菌落平均数， 个

1 范围

本标准规定了化妆品微生物学细菌和霉菌总数的检验。

本标准适用于化妆品细菌和霉菌总数的检测。

2 规范性引用文件

GB 7916 化妆品卫生标准

GB/T 7918 化妆品微生物标准检验方法

QB/T 1684-1993 化妆品检验规则

3 一般规定

细菌总数是指1g或1ml化妆品中所含的活菌数量。测定细菌总数和霉菌总数可用来判明化妆品被微生物污染的程度，以及生产所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。

3.1 方法提要：

本标准采用标准平板计数法。化妆品中污染的微生物种类不同，每种微生物都有它一定

的生理物理特性，培养时对营养要求、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。

在实际工作中，不可能做到满足所有菌种的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使

用的条件下（在卵磷脂、吐温-80营养琼脂上，于37℃培养48h；在虎红琼脂培养基上培养72h)

生长的一群嗜中温的需氧及兼性厌氧的微生物总数。

3.2 仪器

3.2.1 250ml锥形瓶。

3.2.2 电子天平、量筒。

3.2.3 压力蒸汽灭菌锅。

3.2.4 移液管。

3.2.5 灭菌培养皿：直径9cm。

3.2.6 酒精灯。

3.2.7 恒温培养箱。

3.2.8 放大镜。

3.3 培养基和试剂的制备

3.3.1 生理盐水： 氯化钠 8.5g

蒸馏水 1000ml

溶解后，分装到加适量玻璃珠的250ml锥形瓶内，每瓶90ml，经121℃(0.11 MPa)20min高温高压灭菌。

3.3.2 卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基：

制法：称取51g粉状卵磷脂、吐温80-营养琼脂成品培养基加入到1000ml纯水中混合,溶解均匀后分装,经121℃(0.11 MPa) 20min高温高压灭菌，储存于冷暗处备用。