结核分枝杆菌PPE37蛋白对RAW264.7巨噬细胞NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表达的作用

Ningxia Medical UniversityThesis for Application of Master’s DegreeThe effect of NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA expression in RAW264.7 macrophage by PPE37 protein of Mycobacterium tuberculosis Student’s Name: Zhang Ruiqinsupervisor: A.P. Xu GuangxianSubject Category: Medical scienceSpecialty: Clinical Laboratory DiagnosticsMajor: Clinical Microorganism andImmunoregulationCollege: Department of Medical LaboratoryCompletion Date: Apr. 2013基金来源教育部“新世纪优秀人才支持计划”项目项目编号：NCET11-11023国家自然基金资助项目项目编号：30960275项目编号：31160494中国博士后基金项目项目编号：20110491554宁夏医科大学“博士学位建设学科”开放课题项目编号：KF2010-4宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。

除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。

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论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。

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可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。

（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日结核分枝杆菌PPE37蛋白对RAW264.7巨噬细胞NF-κB 、TNF-α、IL-6 mRNA表达的影响摘要目的结核分枝杆菌全基因组测序完成后，研究者发现PE和PPE家族基因占结核分枝杆菌编码区的10％，并且在致病分枝杆菌与非致病的分枝杆菌中存在差异表达。

PPE家族中的PPE37蛋白同时位于结核分枝杆菌毒力有关的RD区。

本论文研究PPE37蛋白在结核分枝杆菌感染机体过程中发挥的免疫调节机制。

方法 1. 利用生物信息学软件（uniprot、protparam、GOR 4、SignaIP 4.1、Bcepred、NetMHC3.2 Server）分析PPE37蛋白的理化性质、二级结构及其B细胞/T细胞抗原表位等结构特征，从而预测PPE37蛋白在结核分枝杆菌感染机体过程中发挥的免疫调控机制。

2. 根据Gene Bank中登录的ppe37基因序列（序列号BX842578），设计（primer premier 5软件）并合成其引物。

利用基因工程技术构建重组克隆载体pEasy E2-ppe37，经PCR、双酶切、基因测序证实无误后，克隆至表达载体pET30a。

重组表达载体pET30a-ppe37经IPTG诱导表达后，利用SDS-PAGE、Western blot分析其表达形式。

利用Ni-NTA琼脂糖柱对表达蛋白进行纯化，并通过AlpHaImager 2200 软件分析其纯化率。

3. 建立重组PPE37蛋白（浓度为100ng/ mL、500ng/ mL、5000ng/ mL）刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞模型，在24h、48h、72h分别收集细胞，提取总RNA，利用反转录引物反转录为cDNA。

建立1000ng/mLLPS刺激巨噬细胞模型作为阳性对照组。

利用基因工程技术构建细胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6的标准质粒，并绘制标准曲线。

利用Real-Time PCR检测上述各个组NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA的表达量。

结果 1. 生物信息软件分析证实PPE37蛋白结构稳定、亲水性强、无信号肽。

在线软件Bcepred显示PPE37蛋白的B细胞优势抗原表位区域为191-192；288-294；332-336；376-387。

在线软件NetMHC3.2 Server显示PPE37蛋白的T细胞优势抗原表位区域为0-9；144-153；156-165；239-248。

这些结果证明PPE37蛋白在结核分枝杆菌感染机体过程中能被B细胞/T细胞识别，从而发挥免疫调控机制。

2. 经PCR、双酶切、基因测序证实成功构建重组表达载体pET30a-ppe37。

将其转化到 E.coli BL21中，经IPTG诱导，重组蛋白以包涵体的形式大量表达。

利用AlpHaImager 2200 软件分析经Ni-NTA琼脂糖柱纯化后的重组蛋白纯化率为96.2%。

3. 通过检测细胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表达量的变化，来观察PPE37蛋白对小鼠RAW264.7巨噬细胞的免疫学效应。

浓度分别为100ng/ mL、500ng/ mL、5000ng/ mL的重组蛋白刺激巨噬细胞，24h后Real-Time PCR检测结果显示与空白对照组相比NF-κB、TNF-αmRNA的表达没有影响（p>0.05），而IL-6 mRNA的表达上调（p<0.05）；48h后NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA的表达显著上调（p<0.05）；72h后NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA的表达显著上调（p<0.05）。

1000ng/ml LPS刺激巨噬细胞，24h、48h、72h均能使NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA的表达显著上调（p<0.05）。

这些差异表达证实ppe37蛋白能引起的巨噬细胞免疫应答反应。

结论在结核分枝杆菌感染机体的过程中PPE37蛋白能够被B细胞、T细胞识别，从而发挥相应的体液免疫、细胞免疫反应。

与此同时PPE37蛋白也可以通过调控细胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6的表达引起巨噬细胞免疫应答反应。

总之，PPE37蛋白在结核分枝杆菌感染机体的过程中发挥重要的免疫学效应。

关键词结核分枝杆菌，PPE37蛋白，RAW264.7巨噬细胞The effect of NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA expression in RAW264.7 macrophage by PPE37 protein ofMycobacterium tuberculosisABSTRACTObjective After the completion of the whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis, researchers found that the PE and PPE family genes accounted for 10% of the coding region of Mycobacterium tuberculosis and it’s expressed differently in pathogenic mycobacteria and non-pathogenic mycobacteria. The PPE37 protein located at Mycobacterium tuberculosis virulence-related RD area. The purpose of this thesis is to research the immunomodulatory mechanisms of PPE37 protein in Mycobacterium tuberculosis infected with human.Methods 1. In order to predict the immune regulation mechanisms of PPE37 protein in the process of Mycobacterium tuberculosis infected with human,we use bioinformatics software（uniprot、protparam、GOR 4、SignaIP 4.1、Bcepred、NetMHC3.2 Server）analysis its structural features.2.According the ppe37 gene sequences logged on Genebank, to design and synthesis its ing genetic engineering techniques to build the pEasyE2-ppe37 recombinant clone carrier ,after confirmed correct by PCR、restriction analysis、gene sequencing cloned it into the expression vector pET30a.The pET30a-ppe37 recombinant expression vector is induced by IPTG. To analysis the expression form of recombinant protein by SDS-PAGE. To analysis the specificity of recombinant protein by Western blot. Using alpHaImager 2200 software to analysis the purification rate of the recombinant protein, after purified by Ni-NTA agarose.3.To establish the mouse RAW264.7 macrophage model stimulated by recombinant PPE37 protein, The concentration of recombinant PPE37 protein is 100ng/ mL、500ng/ mL、5000ng/ mL. After collected the cells respectively (24h,48h,72h ), extract total RNA andanti-transcribed into cDNA using reverse transcription ing genetic engineering techniques to build cytokines (β-actin、NF-κB, TNF-α, IL-6)standard plasmid and draft standard curves. To detect the NF-κB, of TNF-α, of IL-6 mRNA expression various of the above group by Real-Time PCR.Results 1. The PPE37 protein has stable structure, strong hydrophilic and no signal peptide analyzed by bioinformatics software. The online software Bcepred shows PPE37 protein dominant epitopes area in B cells at 191-192; 288-294; 332-336; 376-387. The online softwareNetMHC3.2 Server shows PPE37 protein dominant epitopes area in Tells at 0-9;144-153;156-165;239-248.These results prove PPE37 proteins can be recognized by B cell / T cell in the process of Mycobacterium tuberculosis infection with human,which plays an important immune regulatory mechanism.2.The recombinant expression vector pET30a-ppe37was constructed correctly after confirmed by PCR, restriction, gene sequencing.After transformed into E.coli BL21 and induced by IPTG, the recombinant protein was expressed abundantly in the form of inclusion body proteins.The purification rate of the recombinant protein is 96.2% analyzed by alpHaImager 2200 software after purified by Ni-NTA agarose.KEYWORDS Mycobacterium tuberculosis，PPE37 protein，RAW264.7 macrophages中英文缩略词表英文缩写英文名称中文译文Mtb Mycobacterium tuberculosis 结核分枝杆菌AMP Ampicillin 氨苄青霉素ORF Open Reading Frame 开放阅读框SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基磺酸钠bp base pair 碱基对TNF-αTumor Necrosis Factor 肿瘤坏死因子-αIL-6 Interleukin-6 白介素-6BCA bicinchoninic acid BCA蛋白浓度定量BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNACPE cytopathic effect 细胞病变效应DEPC diethyl pyrocarbonate 焦炭酸二乙酯Dicer Dicer 核糖核酸酶Dicer DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸Ep eppendorf tube 微量离心管h hour 小时Kana Kanamycin 卡那霉素Amp Ampicillin氨苄霉素LB Luria-Bertani LB培养基LPS Lipopolysaccharide 脂多糖min minute 分钟MIC minimal inhibitory concentration 最小抑菌浓度nt nucleotide 核苷酸PAGE Polyacryl amide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液聚合酶链反应PCR polymerase chain reactionqRT-PCR real-time quantitative PCR 实时荧光定量聚合酶链反应RAW264.7 mouse macrophage 小鼠巨噬细胞rpm revolutions per minute 转/分s/sec second秒μL microliter 微升目录一、正文前言 (1)第一部分PPE37蛋白的生物信息学分析以及重组原核表达载体构建 (3)实验材料 (3)实验方法 (4)实验结果 (11)第二部分重组PPE37蛋白的原核表达与纯化 (15)实验材料 (15)实验方法 (17)实验结果 (20)第三部分重组PPE37蛋白与巨噬细胞相互作用的研究 (21)实验材料 (21)实验方法 (24)实验结果 (27)讨论 .................................................................................................. 错误!未定义书签。