尼罗罗非鱼IgT重链的蛋白表达及表达分析曹琦琦;王玉红;仲小芳;陈常仪;王安利【摘要】IgT(Immunoglobulin T)作为新型免疫球蛋白在粘膜免疫中具有重要作用.文中根据尼罗罗非鱼IgT基因序列构建原核表达载体获得IgT重组蛋白,相对分子量约75 kDa,并制备出效价较高的小鼠抗罗非鱼IgT的多克隆抗体.荧光定量PCR检测证明:健康尼罗罗非鱼中IgT在多种组织中都有表达,其中脾脏、皮肤、肠和鳃中表达量相对较高.无乳链球菌感染后,皮肤和头肾中IgT mRNA的相对表达量分别在12 h和4 d显著上调.免疫组化结果显示:IgT蛋白在头肾和皮肤中均有少量分布,在无乳链球菌刺激后,在皮肤中出现大量分布.以上结果表明:IgT在尼罗罗非鱼皮肤粘膜免疫中具有重要作用.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(050)004【总页数】6页(P62-67)【关键词】尼罗罗非鱼;无乳链球菌;IgT;免疫组化;粘膜免疫【作者】曹琦琦;王玉红;仲小芳;陈常仪;王安利【作者单位】华南师范大学生命科学学院∥生态与环境科学广东普通高校重点实验室∥广东省水产健康安全养殖重点实验室,广州510631;华南师范大学生命科学学院∥生态与环境科学广东普通高校重点实验室∥广东省水产健康安全养殖重点实验室,广州510631;华南师范大学生命科学学院∥生态与环境科学广东普通高校重点实验室∥广东省水产健康安全养殖重点实验室,广州510631;华南师范大学生命科学学院∥生态与环境科学广东普通高校重点实验室∥广东省水产健康安全养殖重点实验室,广州510631;华南师范大学生命科学学院∥生态与环境科学广东普通高校重点实验室∥广东省水产健康安全养殖重点实验室,广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q71尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)属鲈形目罗非鱼属，又名非洲鲫鱼，是我国重点养殖的经济鱼类之一. 近年来罗非鱼养殖规模不断扩大，水域环境的不断恶化，鱼类疾病也大范围爆发，给罗非鱼养殖业带来了巨大经济损失. 其中链球菌引起的鱼类疾病是我国罗非鱼养殖过程中最为严重的细菌性病害，其发病率和死亡率高达90%以上，给罗非鱼养殖带来极大的风险. 目前人们多用抗生素来预防和控制链球菌病的发生，但药物容易在动物体内残留，不仅不利于养殖业的持续发展，也会给消费者的健康带来威胁. 因此，研制安全高效的疫苗迫在眉睫.鱼类是最早开始产生免疫球蛋白的脊椎动物，作为体液免疫系统中重要的效应分子，免疫球蛋白为有颌类脊椎动物所特有[1]. 同高等脊椎动物一样，鱼类既存在体液免疫，也存在粘膜免疫系统[2]. 2005年，在斑马鱼(Barchydanio rerio var)中首次发现一种不同于IgM和IgD的新型免疫球蛋白[3]，几乎同时，在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)中也发现了一种新型的免疫球蛋白重链基因，命名为IgT[4]. 后来的报道显示IgT几乎存在于所有的硬骨鱼中，如红鳍东方鲀(Fugu rubripes)[5]、大西洋鲑鱼(Salmo salar)[6]、鲤鱼(Cyprinus carpio)[7]等. 虽然它们的命名不同，但系统进化分析表明：它们都属于同一家族. 因其为硬骨鱼特有，现在趋向于将其以硬骨鱼(Teleost)首字母命名为IgT[8]. 研究发现在斑马鱼中IgT主要在初级淋巴组织中表达，同时发现的IgT-2可在初级和次级淋巴组织中表达[9]. 在虹鳟肠粘液发现IgT和IgM同时存在. IgT为四聚体，和哺乳类IgA类似，通过多聚免疫球蛋白受体(Poly-meric Immunoglobulin Receptor, pIgR)转运至肠腔，并在肠粘膜免疫中发挥重要作用[10]. 此外，虹鳟皮肤和腮粘液中IgT和IgM同时存在，且在组织的粘膜免疫应答中起重要作用. 虽然IgM和IgT都可以结合在小瓜虫的表面，但更多小瓜虫的被IgT附着，IgT在粘膜免疫应答中发挥主要作用[11-12]. 目前，尚未有尼罗罗非鱼分泌型IgT相关研究的报道.本文根据尼罗罗非鱼IgT基因序列(Genbank登录号：KY626108)构建原核表达载体，体外表达IgT蛋白，并制备多克隆抗体. 用无乳链球菌感染尼罗罗非鱼，qRT-PCR检测其IgT mRNA水平的表达，对比分析不同组织表达的差异，通过免疫组化检测无乳链球菌感染对IgT蛋白表达的影响，为进一步研究IgT在粘膜免疫反应中的作用和新型疫苗的研发提供科学依据.1 材料与方法1.1 材料尼罗罗非鱼，购自广东省渔业种质保护中心，养殖条件为28 ～30 ℃，早晚投喂饲料，加气泵供氧；实验用小鼠，BALB/c，8周；无乳链球菌菌株为本实验室保存菌株；PCR反应体系所用试剂、pMD-18T Vector、限制性内切酶、Trizol、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自TaKaRa公司；E.coli DH5α、BL21(DE3)感受态、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自天根公司；pET32a(+) Vector由本实验室保存；PCR引物由北京华大基因有限公司合成.1.2 方法1.2.1 目的基因的克隆采用Trizol法提取尼罗罗非鱼各组织的总RNA，实验步骤参照RNAiso Plus说明书操作. 按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)操作说明进行反转录成cDNA. 以尼罗罗非鱼IgT基因片段为模板，用加有EcoRⅠ和HindⅢ 酶切位点的特异性引物(表1) PCR扩增尼罗罗非鱼IgT基因片段，将目的片段克隆到pMD-18T，获得重组质粒pMD-18T-IgT. EcoRⅠ和HindⅢ 酶切质粒pMD-18T-IgT、pET32a，将目的片段与表达载体连接，转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，挑取单克隆测序.1.2.2 蛋白表达与纯化测序正确的菌株，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(1.0 mmol/L，4 h)诱导表达，收集诱导菌体，12 000 r/min离心收集菌沉淀，用20 mL无菌PBS重悬菌体，加入溶菌酶至终质量浓度为1 g/L，室温放置1.5 h后，超声(开3 s，关2 s)破碎30 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，用banding buffers结合溶解过夜，并对重组蛋白进行可溶性分析. 根据蛋白纯化试剂盒His.band Resin(Novagen) 说明书纯化目的蛋白并检测.1.2.3 多克隆抗体制备与检测将纯化后的重组蛋白透析浓缩并与弗氏佐剂(SIGMA)混合，腹腔注射免疫小鼠. 首次免疫使用弗氏完全佐剂，再次免疫使用弗氏不完全佐剂，每次注射免疫蛋白用量为每只小鼠50 μg. 尾部静脉取血，获得抗血清后通过直接ELISA检测效价.1.2.4 无乳链球菌感染实验取60尾100 g左右的健康尼罗罗非鱼随机分成2组，即实验组和对照组，分别腹腔注射100 μL 5 × 105 CFU/μL的链球菌和无菌的PBS(CFU为菌落形成单位)[13]. 免疫前分别取胸腺、头肾、脾脏、肝脏、肠道、皮肤、鳃和肌肉组织，用于组织表达分析. 选取免疫后6、12、24 h和2、4、6、8、11、15 d共9个时间点取头肾和皮肤组织，用于组织表达分析.1.2.5 IgT mRNA在尼罗罗非鱼组织中表达分析定量检测引物和内参引物见表1，按照SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒操作，使用ABI 7500 real-time PCR 仪(Applied Biosystems, USA) 进行实时定量PCR反应. 扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，循环40次. 选用β-actin作为内参基因. 应用2-ΔΔCt法确定IgT mRNA表达量[14]. 用统计学软件SPSS19.0中的单向方差分析法(ANOVA)进行分析.表1 实验所用引物序列Tab. 1 Sequences of primers used in this study引物引物序列 (5'-3')IgT F1CCGGAATTCCGGAGTGAGATCAAACTGGACIgTR1CCCAAGCTTGGGATTTCATTGACTTGTTCβ-actin-DAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGGGCβ-actin-FCGAGAGGGAAATCGTGCGTGACATi-IgTF1GGATTACTACATCGCCTGGAGATi-IgT R1CTCGGGATTTCATTGACTTGTT 1.2.6 免疫组织化学分析根根据荧光定量分析结果，将组织常规固定，采用EnVisionTM免疫组织化学两步法，主要步骤包括：切片用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱苯，去离子水水化，3%过氧化氢溶液室温避光孵育25 min以阻断内源性过氧化物酶，3%BSA室温封闭30 min后滴加一抗，4 ℃孵育过夜；二抗室温孵育30 min；二甲基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)显色，苏木素复染；水洗后脱水透明，晾干用中性树胶封片，显微镜镜检，苏木素染细胞核为蓝色，显色阳性表达为棕黄色.1.2.7 血清和粘液IgT蛋白的检测收集尼罗罗非鱼血清和粘液(使用盖玻片刮取尼罗罗非鱼粘液，加入10 mL PMSF，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液)，将收集的血清与粘液置于冻干机内浓缩4 h. 分别取等量粘液和血清，用小鼠抗尼罗罗非鱼IgT多克隆抗体为一抗Western-blotting检测血清和粘液中IgT蛋白.2 结果与分析2.1 IgT cDNA的克隆及原核表达2.1.1 IgT cDNA的克隆以前期获得的尼罗罗非鱼IgT cDNA片段为模板，用特异性引物(表1)成功扩增到长度为1 557 bp的基因片段(图1)，将目的基因克隆连接pET32a转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性克隆测序，序列分析表明：克隆中DNA序列与石斑鱼IgT基因序列相似度95.2%.2.1.2 尼罗罗非鱼IgT基因的原核表达将测序正确的E.coli BL21(DE3)菌株(pET32a-IgT)，30 ℃的培养条件下，加入IPTG诱导蛋白表达. 以诱导空载体pET32a和不做诱导的重组质粒为对照. 推测IgT的相对分子量为54 kDa，载体标签蛋白的相对分子量为21 kDa，因此，pET32a-IgT的相对分子量约为75 kDa. SDS-PAGE结果显示，pET32a-IgT重组质粒和对照相比，在相对分子量75 kDa 处出现了一条明显的蛋白条带，其大小与IgT预测的相对分子量相近(图2A). 将菌体经过超声波破碎后，发现重组蛋白是以包涵体的形式存在(图2B).M：DL2 000 Marker;1:扩增产物图1 尼罗罗非鱼IgT基因片段的PCR的扩增Figure 1 Amplification of IgT gene fragments from Nile tilapiaM：预染10～170 kDa Marker;1:空载菌;2：未经诱导的重组菌;3：经诱导的重组菌(A)IgT重组蛋白的表达结果M：预染10～170 kDa Marker;1:蛋白上清液;2：蛋白沉淀(B)IgT重组蛋白的表达与可溶性分析图2 IgT重组蛋白的表达与可溶性分析Figure 2 Expression and solubility analysis of IgT recombinant protein2.2 IgT重组蛋白纯化及多抗的制备与检测利用His-tag纯化IgT重组蛋白， SDS-PAGE检测显示，在相对分子量75 kDa 处有单一条带(图3A). 透析浓缩后制做抗原免疫小鼠，获得抗血清，ELISA检测其效价为300 000 U/mL. 用该抗血清Western-blotting检测IgT融合蛋白，结果显示在相对分子量75 kDa处存在明显的条带(图3B)，实验制备的小鼠抗尼罗罗非鱼IgT抗血清效果良好.M：预染10～170 kDa Marker;1:纯化的IgT重组蛋白图3 IgT重组蛋白及多克隆抗体的检测Figure 3 Detection of recombinant protein and polyclonal antibody2.3 尼罗罗非鱼IgT mRNA的组织表达分析采用qRT-PCR方法检测IgT mRNA在健康尼罗罗非鱼中不同组织的相对表达量. 结果表明：在所检测的8个组织中，脾脏中IgT mRNA的表达量最高，皮肤和肠道等粘膜组织也有较高的表达，肌肉组织中几乎不表达(图4).图4 健康尼罗罗非鱼IgT mRNA在组织中的表达Figure 4 The expression of IgT in tissues of healthy Nile tilapia2.4 尼罗罗非鱼IgT的无乳链球菌感染表达分析2.4.1 IgT mRNA的表达分析 qRT-PCR检测头肾和皮肤组织中IgT mRNA在链球菌感染后的表达量变化(图5)，结果显示，感染后皮肤和头肾均上调表达，头肾在感染12 h的相对表达量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)(图5A)，皮肤中相对表达量在免疫4 d时高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，在6 d时的相对表达量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)(图5B).图5 链球菌感染后尼罗罗非鱼IgT mRNA在头肾及皮肤中的表达变化Figure 5 The expression of IgT mRNA in head kidney and skin of Nile tilapia after the infection of S.agalactiae注：*表示差异有统计学意义(P<0.05),**表示差异有统计学意义(P<0.01)2.4.2 IgT蛋白的表达分析通过免疫组织化学技术检测免疫后头肾和皮肤中IgT蛋白的表达(图6)，结果显示，与对照组相比，免疫后在头肾组织中IgT蛋白出现大量表达(图6A、B)，而皮肤组织中IgT蛋白出现极显著的表达(图6C、D).2.5 尼罗罗非鱼血清和粘液IgT蛋白的检测取浓缩后的尼罗罗非鱼血清和粘液为样品，以小鼠抗尼罗罗非鱼IgT多克隆抗体为一抗，Western-blotting检测尼罗罗非鱼血清和粘液中IgT蛋白. 结果显示，血清和粘液中均在相对分子量68 kDa处存在明显的目的条带，且粘液中的目的蛋白含量大于血清中的含量(图7).箭头表示阳性较为显著的部分图6 免疫组化检测尼罗罗非鱼头肾和皮肤中IgT的表达Figure 6 The expression of IgT in head kidney and skin of infected Nile tilapia by immunocytochemistryM：预染10～170 kDa Marker;1:血清;2：粘液;箭头表示目标条带图7 尼罗罗非鱼血清和粘液中IgT的Western-bloting检测Figure 7 Detection of IgT protein in serum and mucus of Nile tilapia3 讨论粘膜免疫具有局部特异性免疫功能，与系统免疫共同组成机体免疫系统. 在哺乳动物和鸟类中，参与粘膜免疫的主要免疫球蛋白是IgA，两栖类是IgX，而在鱼类中则是IgT. 目前，尽管IgT在多种硬骨鱼中都有报道，且已经证实在虹鳟的皮肤黏膜抗寄生虫感染免疫中起重要的作用[10]，但目前在尼罗罗非鱼中分泌型IgT相关研究还尚未见报道.本研究利用原核表达载体pET32a(+)构建了尼罗罗非鱼IgT基因体外重组表达体(pET32a-tIgT)，通过IPTG诱导以后SDS-PAGE分析，发现表达产物稳定，相对分子质量与预期相符，说明原核表达系统构建成功.一般来说，表达量越高越容易形成包涵体. 在包涵体中表达的蛋白一般不具有活性. 但包涵体也有一定的优势，其致密的结构能有效防止蛋白酶对目的蛋白的降解. SDS-PAGE电泳结果显示：IgT主要在包涵体中表达(图2B)，且纯化后的蛋白未出现降解(图3A)，透析复性获得具有一定生物活性的IgT重组蛋白，可用来制备高效价的多克隆抗体. 以该抗血清为一抗，Western-blotting检测到IgT重组蛋白条带(图3B)，小鼠抗尼罗罗非鱼IgT多克隆抗体制备成功.尼罗罗非鱼IgT主要在脾脏、皮肤和肠道中表达，其次是鳃、胸腺和肝脏，头肾中也有部分表达，而在肌肉组织中几乎不表达(图4). 这种表达模式与鳜鱼[15]、剑尾鱼[16]和香鱼[17]相似. 脾脏是鱼类重要的二级免疫器官，是机体免疫应答的主要场所. 皮肤作为硬骨鱼粘膜相关淋巴组织之一，它包含各种白细胞，包括T细胞、B细胞、浆细胞、巨噬细胞和粒细胞等，并且在维持粘膜稳态中起关键作用[11].在应对病原微生物感染时，皮肤等粘膜组织具有重要的免疫防御功能. 以上研究表明，脾脏可能是粘膜免疫反应抗原呈递的主要器官，而皮肤则是粘膜免疫反应的主要组织.头肾既是硬骨鱼类的主要免疫器官，又是重要的造血器官，在功能上相当于高等脊椎动物的脊髓. 头肾是免疫细胞如巨噬细胞、颗粒细胞、B淋巴细胞发生、分化和增殖的重要场所，也是捕获抗原和产生抗体的主要器官，对鱼体的免疫反应具有重要作用[18]. 在腹腔注射链球菌12 h后，头肾中IgT mRNA显著上调表达(图5A)，鲤鱼[7]和剑尾鱼[16]在外界抗原刺激后，IgT基因在头肾表达水平也都表现出明显上调. 可能是因为在感染条件下尼罗罗非鱼头肾组织中B淋巴细胞迅速增殖. 尼罗罗非鱼头肾组织中IgT在免疫后的12 h达到最高水平，是对照组的3.8倍，之后则处于低水平表达. B淋巴细胞在头肾等中枢免疫器官中成熟后会被转运到外周免疫器官参与免疫反应，产生抗体. 这表明头肾中的IgT+B细胞在抵御外界病原微生物时具有重要作用.尼罗罗非鱼皮肤中的免疫反应相对滞后，在免疫刺激24 h之后，IgT的表达量逐步上升，在免疫后的第4天显著上调，第6天达到峰值，其相对表达量是对照组的6.7倍，之后开始下降(图5B). 无乳链球菌是感染尼罗罗非鱼的主要病原菌，可引起粘膜的损伤. 在病原菌免疫刺激下，皮肤组织中的IgT+B细胞增殖分化，IgT mRNA出现显著上调表达，产生大量的IgT蛋白. 免疫组化结果显示:免疫感染后，IgT蛋白在头肾组织中的表达量增加，在皮肤中的表达出现极显著上升(图6)，且Western-blotting结果显示:IgT蛋白在粘液中的表达量高于血清(图7)，表明尼罗罗非鱼IgT主要在粘膜免疫中起作用，在系统免疫中有一定的作用. 此外，尼罗罗非鱼皮肤粘液中的IgT由皮肤组织中IgT+ B细胞分化产生的浆细胞分泌，经转运至皮肤粘液并在粘膜免疫中发挥重要作用.以小鼠抗尼罗罗非鱼IgT抗血清为一抗，Western-blotting检测尼罗罗非鱼血清和粘液中的IgT,发现在相对分子量小于70 kDa处存在一条明显的杂交带，大小约为68 kDa(图7)，与草鱼[19]及虹鳟[8]IgT重链蛋白大小相似. 目的蛋白相对分子量稍大于IgT重链蛋白的预测相对分子量(60.1 kDa)，可能是天然蛋白存在糖基化或其他蛋白修饰所造成的. 因此，可推测Western-blotting所得的杂交带为尼罗罗非鱼天然IgT重链蛋白. 在尼罗罗非鱼血清和粘液中检测到的IgT蛋白是否同虹鳟一致？在功能上血清和粘液中的IgT蛋白是否相同？这些都有待进一步研究.参考文献：【相关文献】[1] WARR G W. The immunoglobulin genes of fish[J]. Developmental & Comparative Immunology,1995,19(1):1-12.[2] 罗晓春，谢明权，黄玮，等. 鱼类粘膜免疫研究进展[J]. 水产学报,2005,29(3):411-416.LUO X C,XIE M Q,HUANG W,et al. Review of fish mucosal immunity research [J]. 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