病毒的遗传分析

红眼病病毒遗传变异分析红眼病是一种常见的传染病，也称为流行性感冒性结膜炎。

该病毒属于腺病毒科，是一种DNA病毒，具有外壳和一个核心。

在不同地区和时间，红眼病病毒会发生不同的遗传变异，这对于疫苗和药物的开发具有重要的意义。

遗传结构和变异红眼病病毒的遗传结构包括两个重要的特征：一个是病毒壳体蛋白，另一个是免疫原性毒素蛋白。

这两个特征决定了病毒的侵入性和致病力。

红眼病病毒具有高度的变异能力，这是由其特殊的复制方式所决定的。

在感染人体时，病毒会在基因组复制的过程中频繁发生错误，这导致了基因序列的随机变化。

如果累积的错误达到一定数量，会引起突变。

突变后，病毒的构成和性质就会发生变化，甚至会产生新的亚型。

遗传变异的影响红眼病病毒的遗传变异对临床治疗和预防具有影响。

当病毒发生变异时，可能会导致对治疗药物和疫苗的抵抗性增强。

因此，红眼病病毒的遗传变异，使得对其进行疫苗和药物的研发变得更为困难。

研究方法和发展为了更好地研究红眼病病毒的遗传变异，科学家们使用了许多不同的技术手段。

其中，分子病毒学是一种比较先进的方法。

利用这种方法，可以对病毒基因组进行深入的分析，以确定遗传差别和变异点。

同时，该方法还可以帮助科学家确定红眼病病毒的遗传进化路径，从而为疫苗和药物的开发提供基础数据。

总结红眼病是一种非常常见的传染病，对人体健康造成较大的威胁。

由于红眼病病毒的遗传变异，使得治疗和预防的难度加大。

科学家们利用现有的技术手段，对病毒进行研究，不断探索其遗传结构和变异情况。

相信在今后的科学研究中，我们能够找到更好的治疗和预防方法，促进人类健康事业的发展。

病毒进化和生态遗传学特征分析在当前的全球环境中，病毒的进化和变异是一个备受关注的话题。

随着科技的不断进步，我们越来越了解到病毒的生态遗传学特征，这对于我们预测和控制病毒传播具有重要的意义。

一、病毒生态系统及其进化病毒生态系统包括病毒、寄主和环境因素等。

病毒的进化和演化是受到这些因素的共同影响的。

寄主的免疫力不断发展，病毒需要不断的适应和进化才能在寄主中存活下来。

此外，环境因素如气候、地理位置等也会对病毒的演化和分布产生影响。

病毒的进化是非常快速和复杂的过程，它可能产生新的病毒毒株，这可能对大众的健康和医疗产生很大的危害。

正确的预测和有效的控制是相当重要的。

二、生态遗传学特征的分析生态遗传学的研究重点是遗传变异和环境适应性之间的关系，这对于理解病毒的进化规律和遗传策略有着重要的启示。

1. 基因突变病毒的存在依赖于基因组的完整性和准确性，任何基因的突变都可能影响病毒的功能。

这种突变可能是病毒DNA或RNA序列改变、插入、删除等，导致了在病毒毒株中的遗传变异。

2. 基因重组基因重组是指两种不同病毒的基因互相组合形成新的毒株。

这个过程通常发生在两种病毒感染同一个寄主的情况下，遗传物质之间的交互会产生新的遗传特征。

3. 病毒适应性进化随着寄主的进化和免疫系统的演化，病毒也在不断地调整自己的适应性属性以避免被免疫系统攻击。

病毒分成两种：一种是利用旧的特征来适应新的环境；另一种则是在新的环境中产生新的变化，以适应当前的情况。

三、对于病毒进化和生态遗传学特征的控制策略基因突变和重组是病毒演化的关键，控制的策略有以下几个方面：1. 加强公共卫生意识对于病毒的早期检测和隔离是非常重要的，通过大力宣传公共卫生意识，增加大众的疫情认知度和疫情预防意识，是真正有效遏制病毒的传播和进化。

2. 病毒监测和追踪对于不同地区不同时期的病毒状况进行监测和追踪，并及时报告疫情情况，可以获得及时的消息，为疫情预测和控制提供更有意义的信息。

中国畜牧兽医 2024,51(4):1642-1650C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析韩 慧1,郭亚晶1,颜广智2,陈盛楠2,刘明杰2,莫美连2,黄良宗1(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院,佛山528000;2.广东方道基因生物科技有限公司,佛山528000)摘 要:ʌ目的ɔ了解广东地区猪流感病毒(S w i n e i n f l u e n z a v i r u s ,S I V )的流行情况并探究其分子生物学特征㊂ʌ方法ɔ采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定㊁遗传进化和关键氨基酸位点分析㊂ʌ结果ɔ样品经实时荧光定量R T -P C R 检测为猪流感病毒核酸阳性;在红细胞凝集试验中,该病毒对鸡红细胞有凝集作用,血凝效价为1ʒ128;8个基因片段序列结果经B L A S T 比对和进化树分析显示,HA ㊁N A 基因属于欧亚类禽猪流感病毒(H 1N 1)分支,P A ㊁P B 1㊁P B 2㊁N P 和M 基因属p d m /09分支,N S 基因属于北美三源重组分支,因此,本试验分离株属于G 4基因型欧亚类禽猪流感病毒,将其命名为A /s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1)㊂关键氨基酸位点分析显示,分离株HA 蛋白裂解位点序列为P S I Q S R /G L ,具有典型低致病性流感病毒的分子特征㊂HA 基因在受体结合位点处的190㊁225㊁226位氨基酸分别为D ㊁E ㊁Q ,表明其既具有结合人型唾液酸受体的潜能又具有结合禽型唾液酸受体的潜能㊂N A 基因关键氨基酸残基均未发生突变,提示分离株对奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂的敏感性较高,而M 基因3处氨基酸位点突变为V 27A ㊁A 30T ㊁D 44A ,提示对金刚烷胺类药物耐药性增加㊂ʌ结论ɔ本研究分离鉴定的毒株为G 4基因型欧亚类禽猪流感病毒,关键氨基酸位点分析提示该毒株具有适应在哺乳动物中复制和毒力增强的特征㊂本研究结果为广东地区猪流感的防控提供了参考数据㊂关键词:欧亚类禽猪流感病毒;分离鉴定;序列分析;H 1N 1亚型中图分类号:S 852.65+1文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.04.032 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-11-17基金项目:广东省自然科学基金项目(2017A 030310612)联系方式:韩慧,E -m a i l :1570387219@q q .c o m ㊂通信作者黄良宗,E -m a i l :l i a n g z o n g h u a n g@f o s u .e d u .c n I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o na n dG e n e t i cE v o l u t i o nA n a l ys i s o f a E u r a s i a nA v i a n -l i k e S w i n e I n f l u e n z aV i r u sH A N H u i 1,G U O Y a j i n g 1,Y A N G u a n g z h i 2,C H E NS h e n gn a n 2,L I U M i n g j i e 2,MO M e i l i a n 2,HU A N GL i a n g z o n g1(1.S c h o o l o f L i f eS c i e n c e a n dE n g i n e e r i n g ,F o s h a nU n i v e r s i t y ,Fo s h a n 528000,C h i n a ;2.G u a n g d o n g F i n d e r g e n eB i o t e c h n o l o g y C o .,L t d .,F o s h a n 528000,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e e x pe r i m e n tw a s a i m e d t ou n d e r s t a n d t h e p r e v a l e n c e of S w i n e i n f l u e n z a v i r u s (S I V )i n G u a ng d o n g a n de x p l o r e i t sm o l e c u l a rb i o l o g i c a l ch a r a c t e ri s t i c s .ʌM e t h o d ɔN a s a l s w a ba n dl u n g t i s s u es a m p l e so f p i g ss u s pe c t e dt ob e i nf e c t e d w i t hS w i n e i n f l u e n z av i r u sw e r e c o l l e c t e d f r o ma p ig f a r m i nG u a n g d o n g f o r v i r u s i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n ,g e n e t i c e v o l u t i o n a n d k e y a m i n o a c i d s i t e a n a l y s i s .ʌR e s u l t ɔTh e s a m pl e sw e r e t e s t e d p o s i t i v e f o rS w i n e i n f l u e n z av i r u s n u c l e i c a c i db y R e a l -t i m e q u a n t i t a t i v eR T -P C R.I n t h e r e db l o o dc e l l a g gl u t i n a t i o n t e s t ,t h ev i r u s e x h i b i t e d a g g l u t i n a t i o nw i t h c h i c k e n r e db l o o d c e l l s ,w i t hah e m a g gl u t i n a t i o n t i t e r o f 1ʒ128.T h e r e s u l t s o f s e q u e n c i n g a n a l y s i so f e i g h t g e n es e g m e n t sw e r ea n a l y z e db y B L A S Tc o m pa r i s o na n d4期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析c o n s t r u c t i o no fe v o l u t i o n a r y t r e e s,a nd HA a n d N A ge n e sb e l o n g e dt ot h eE u r a s i a na v i a n-l i k e S w i n e i nf l u e n z av i r u s(H1N1)b r a n c h,P A,P B1,P B2,N P a n d Mg e n e sb e l o n g e d t o th e p d m/09 b r a n c h,a n d N S g e n eb e l o n g e dt ot h e N o r t h A m e ri c a nt r i p l er e a s s o r t a n tb r a n c h,t h e r e f o r e,t h e i s o l a t e i n t h i s s t u d y b e l o n g e dt o t h eG4g e n o t y p eE u r a s i a na v i a n-l i k eS w i n e i n f l u e n z av i r u s,a n d w a s n a m e dA/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022(H1N1).K e y a m i n oa c i ds i t e a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e c l e a v a g e s i t e s e q u e n c e o fH A p r o t e i no f t h e i s o l a t ew a sP S I Q S R/G L,w h i c hh a d t h em o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i c s o f a t y p i c a l l o w p a t h o g e n i c i t y i n f l u e n z a v i r u s.T h e a m i n o a c i d s a t p o s i t i o n190,225 a n d226o f t h e r e c e p t o rb i n d i n g s i t eo f HA g e n ew e r eD,Ea n dQ,r e s p e c t i v e l y,w h i c hs u g g e s t e d t h a t i t h a dt h e p o t e n t i a l a b i l i t y t ob i n dt ot h eh u m a ns a l i v a r y a c i dr e c e p t o ra n d i ta l s oh a dt h e p o t e n t i a l t ob i n da v i a ns i a l i ca c i dr e c e p t o r s.N o n eo f t h ea m i n oa c i dr e s i d u e so f N A g e n ew e r e m u t a t e d,s u g g e s t i n g t h a t t h e i s o l a t ew a s s e n s i t i v e t on e u r a m i n i d a s e i n h i b i t o r s s u c ha s o s e l t a m i v i r a n d z a n a m i v i r.H o w e v e r,t h em u t a t i o n s a t t h r e e a m i n o a c i d s i t e s i n M g e n ew e r eV27A,A30Ta n d D44A,s u g g e s t i n g a ni n c r e a s e dr e s i s t a n c et oa m a n t a d i n e-b a s e dd r u g s.ʌC o n c l u s i o nɔT h es t r a i n i s o l a t e da n di d e n t i f i e di nt h i ss t u d y w a sa G4E u r a s i a na v i a n-l i k eS w i n ei n f l u e n z av i r u s.T h e a n a l y s i s o f k e y a m i n oa c i ds i t e ss u g g e s t e dt h a t t h i ss t r a i nh a dt h ec h a r a c t e r i s t i c so f a d a p t i n g t o r e p l i c a t i o na n d e n h a n c i n g v i r u l e n c e i nm a m m a l s.T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d yp r o v i d e d r e f e r e n c e d a t a f o r t h e p r e v e n t i o na n d c o n t r o l o f s w i n e i n f l u e n z a i nG u a n g d o n g.K e y w o r d s:E u r a s i a n a v i a n-l i k e S w i n ei n f l u e n z a v i r u s;i s o l a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o n;s e q u e n c e a n a l y s i s;H1N1s u b t y p e猪流感是由猪流感病毒(S w i n ei n f l u e n z a v i r u s,S I V)引起的猪的一种急性呼吸道传染病,临床症状以咳嗽㊁流鼻涕㊁发热㊁食欲减退为主[1]㊂猪的呼吸道上皮细胞同时具有α-2,3和α-2,6两种唾液酸(s i a l i c a c i d,S A)受体,能感染人流感病毒和禽流感病毒,不同流感病毒同时感染猪时极易发生基因重排而产生新的流行毒株,所以猪被认为是流感病毒发生基因重排的 混合器 [2-3]㊂流感病毒的重排是产生具有新抗原性和生物学特性的子代病毒的主要机制,可导致流感灾难性的大流行㊂不同亚型S I V在世界范围内猪群中呈地区性流行,其中以H1N1亚型S I V最为常见㊂H1N1亚型S I V又可分为经典H1N1亚型(C l a s s i c a l s w i n e i n f l u e n z a v i r u s,C S H1N1S I V)和欧亚类禽H1N1亚型(E u r a s i a na v i a n-l i k e H1N1S w i n ei n f l u e n z a v i r u s,E A H1N1S I V)等㊂E A H1N1亚型S I V于1979年在欧洲猪群中首次被报道,之后欧洲H1N1亚型S I V主体变成了E A H1N1亚型S I V[4]㊂中国E A H1N1分支于2001年首先报道于香港,随后在各地猪群中传播开来,分离率不断上升,目前已成为中国猪群中流行的优势毒株[5]㊂2009年,墨西哥暴发了席卷全球人群的甲型H1N1(P a n d e m i cH1N1 i n2009,p d m/09H1N1)流感病毒,成为21世纪第1次流感大流行,在全球范围内造成18000多人死亡[6]㊂大流行之后p d m/09H1N1毒株在人群中持续传播并传入猪群,p d m/09H1N1毒株在猪群中与E A H1N1亚型S I V等多种流行病毒发生基因重排,极大地危害了人类的公共健康[7]㊂2018年,猪群中E A H1N1亚型S I V与p d m/09H1N1亚型S I V等重排形成了多种基因型,其中G4基因型的重排方式是:HA和N A基因来自于E A H1N1亚型S I V,N S基因来自北美三源重排S I V,其余内部基因来自p d m/09H1N1亚型S I V[8-10],因此,这种G4基因型病毒对公共卫生构成更严重的威胁㊂目前,E A H1N1亚型S I V在中国南方的猪群中广泛传播,给人类健康带来严重威胁[11-12],因此,监测该地区S I V的流行和变异情况具有重要意义㊂2022年12月,在广东某猪场采集一批猪鼻拭子和肺脏组织样品,进行病毒分离鉴定,并对分离病毒进行全基因组基因测序和遗传进化分析,以了解分离病毒的起源及遗传进化特征,为广东省猪流感综合防控提供参考依据㊂1材料与方法1.1病料、S P F鸡胚病料为采集于广东省某猪场的猪肺脏组织和鼻拭子;9~10日龄S P F鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司㊂3461中国畜牧兽医51卷1.2主要试剂2ˑP h a n t aM a x M a s t e rM i x(D y eP l u s)㊁R N A 提取试剂盒(R N AI s o l a t e rT o t a lR N A E x t r a c t i o n R e a g e n t)㊁反转录试剂盒(H i S c r i p tⅡ1s tS t r a n d c D N AS y n t h e s i sK i t)㊁胶回收试剂盒(F a s t P u r eG e l D N A E x t r a c t i o n M i n iK i t)均购自南京诺唯赞生物科技有限公司;D L2000D N A M a r k e r购自天根生化科技(北京)有限公司㊂1.3病毒分离、鉴定及纯化将肺脏组织研磨液和鼻拭子液8000r/m i n离心5m i n,取上清过0.22μm滤膜除菌,接种于9~ 10日龄S P F鸡胚尿囊腔中,于37ħ恒温培养箱培养,去除24h内死亡鸡胚,72h后收集鸡胚尿囊液㊂按照上述方法将尿囊液再次接种鸡胚盲传2代,收集第3代尿囊液,通过S I V实时荧光定量R T-P C R 检测方法[13]和鸡红细胞凝集试验鉴定获得的病毒液,于-80ħ保存备用㊂鸡红细胞凝集试验是在V 形孔微量血凝板上将1%鸡红细胞与不同倍比稀释度的病毒反应,将血凝板倾斜70ʎ,观察沉淀于孔底的红细胞是否向下呈线状流动,以出现全部凝集(红细胞无流动)的最大稀释度为本分离株的血凝效价㊂1.4病毒全基因组扩增按照R N A提取试剂盒说明书提取病毒R N A,使用反转录通用引物(U n i12:5'-A G C A A A A G C A-G G-3')按照反转录试剂盒使用说明书进行反转录,合成c D N A㊂P C R引物参照H o f f m a n n等[14]建立的流感病毒全基因扩增方法合成,引物信息见表1㊂引物均由金唯智生物科技有限公司合成㊂根据高保真酶2ˑP h a n t aM a xM a s t e rM i x(D y e P l u s)说明书分别扩增分离株的8个基因(P B1㊁P B2㊁P A㊁H A㊁N A㊁N P㊁M和N S基因)节段㊂P C R反应体系50μL:2ˑP h a n t aM a xM a s t e rM i x(D y e p l u s)25μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各2μL,c D N A模板3μL,d d H2O补至50μL㊂P C R反应条件:95ħ预变性3m i n;95ħ变性15s,58ħ退火15s,72ħ延伸2m i n,共35个循环;72ħ延伸5m i n㊂P C R产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定㊂扩增产物用胶回收试剂盒回收并送金唯智生物科技有限公司进行测序㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')产物大小P r o d u c t s i z e/b pP B2F:T A T T G G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G T C R:A T A T G G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T C G T T T2341 P B1F:T A T T C G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G C A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G C A T T T2341 P A F:T A T T C G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G T C A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T A C T T2233 H A F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T G T T T T1778 N A F:T A T T G G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G A G T R:A T A T G G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G A G T T T T T T1565 N P F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G T A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T A T T T T T1413 M F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G T A G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T A G T T T T T1027 N S F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G T G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T G T T T T8901.5病毒遗传进化分析测序结果通过S e q M a n软件拼接,N C B I网站在线B L A S T进行序列比对㊁相似性分析,通过N e t N G l y c1.0软件(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/se r v i c e s/N e t N G l y c-1.0/)分析预测潜在糖基化位点,在G e n B a n k中下载参考序列,使用M e g a7.0基于N e i g h b o r-J o i n i n g方法构建遗传进化树,B o o t s t r a p值为1000㊂2结果2.1病毒分离鉴定经S I V实时荧光定量R T-P C R检测,鸡胚尿囊液样品C t值为20.88,判定为S I V核酸阳性(图1)㊂将收获的鸡胚尿囊液进行红细胞凝集试验,结果显示,有血凝性,血凝效价为1ʒ128㊂将分离得到的毒株命名为A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022㊂2.2分离株全基因组测序通过R T-P C R对病毒的8个基因片段进行扩增,得到P B1㊁P B2㊁P A㊁HA㊁N A㊁N P㊁M和N S8个基因片段,大小分别为2341㊁2341㊁2233㊁1778㊁1565㊁1413㊁1027和890b p(图2),与预期目的条带大小相符㊂44614期韩 慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析1,鸡胚尿囊液;2,阴性对照1,C h i c k e ne m b r y o a l l a n t o i c f l u i d ;2,N e g a t i v e c o n t r o l 图1 实时荧光定量R T -P C R 检测结果F i g.1 R e s u l t s o fR e a l -t i m e q u a n t i t a t i v eR T -P CR M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1~8,P B 1㊁P B 2㊁P A ㊁HA ㊁N A ㊁N P ㊁M 和N S 基因M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1-8,P B 1,P B 2,P A ,HA ,N A ,N P ,M a n d N S g e n e s ,r e s p e c t i v e l y图2 分离株各基因片段P C R 扩增结果电泳图F i g .2 E l e c t r o p h o r e s i so fP C Ra m p l i f i c a t i o nr e s u l t so fe a c h g e n e f r a gm e n t o f t h e i s o l a t e 2.3 遗传进化分析2.3.1 病毒全基因组相似性分析 分离株A/s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022的8个基因片段与G e n B a n k 登录的基因序列比对结果显示,HA ㊁N A ㊁P B 2㊁N P 和M 基因均与2018年在北京出现的A/s w i n e /B e i j i n g/0301/2018(H 1N 1)相似性最高,核苷酸相似性分别为97.94%㊁97.60%㊁97.27%㊁98.31%和98.83%,因此,进一步判定分离毒株属于H 1N 1亚型毒株,并将其命名为A /s w i n e/G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1);P A 基因与A /s w i n e /S h a n d o n g /L Y 142/2017(H 1N 1)的核苷酸相似性最高,为97.65%;N S 基因与A /s w i n e /L i a o n i n g /C Y 1833/2020(H 1N 1)的核苷酸相似性最高,为98.86%;P B 1基因与A /s w i n e /A n h u i /H D 21/2020(H 1N 1))核苷酸相似性最高,为96.92%㊂2.3.2 H A 氨基酸序列分析 分离毒株A/s w i n e /G u a n g d o n g /C J M 2/2022(H 1N 1)HA 基因裂解位点氨基酸序列为P S I Q S R /G L ,与近年来E AH 1N 1亚型S I V H A 裂解位点氨基酸组成相同,裂解位点仅含有1个碱性氨基酸(R ),具有低致病性流感病毒的特征㊂利用N e t N G l y c 1.0软件预测H A 蛋白潜在糖基化位点,结果显示,H A 蛋白具有5个潜在的糖基化位点,分别为26N S T D ㊁38N V T V ㊁288N C T T ㊁493N G T Y 和552N G S L ㊂2.3.3 N A 氨基酸序列分析 分离毒株A /s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1)N A 基因含有7个潜在糖基化位点,分别为44N Q S E ㊁58N N T W ㊁63N Q T Y ㊁68N V S N ㊁88N S S L ㊁146N G T V 和235N G S C,在58位多出1个潜在糖基化位点N N TW ㊂N A 蛋白氨基酸序列对神经氨酸酶抑制剂类药物如扎那米韦和奥司他韦的敏感位点119(E )㊁152(R )㊁275(H )㊁293(R )㊁295(N )的氨基酸残基均未发生突变㊂2.3.4 病毒表面基因遗传进化分析 在N C B I 下载相关序列,通过M e g a 7.0分析软件,将分离株的HA 基因与G e n B a n k 中的C S H 1N 1㊁E AH 1N 1㊁类人型H 1N 1和p d m /09分支代表毒株进行比对分析并构建遗传进化树㊂结果显示,分离株的HA 基因位于E A H 1N 1进化分支(图3);由N A 基因进化树可看出,分离株的N A 基因也位于E A H 1N 1进化分支(图4)㊂5461中 国 畜 牧 兽 医51卷图3 H A 基因进化树F i g .3 P h y l o ge n e t i c t r e e of H Ag e ne 图4 N A 基因进化树F i g .4 P h y l o ge n e t i c t r e e of N Ag e n e 64614期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析2.3.5内部片段基因序列位点分析将分离株的内部片段基因(P B2㊁P B1㊁P A㊁N P㊁M和N S基因)序列进行关键氨基酸位点比对分析㊂P B2蛋白氨基酸位点进行比对发现,T271A㊁A590S和A591R的组合发生了突变㊂P B2蛋白中第431位氨基酸发生了T431M突变,第588位氨基酸发生了T588I突变㊂P B1蛋白的氨基酸位点H436Y发生替换㊂P A蛋白的P224S㊁L295P㊁A515T位点发生替换㊂N P蛋白中K319N㊁Q357K位点发生替换㊂M蛋白的V27A㊁A30T㊁D44A位点发生替换㊂N S蛋白关键氨基酸位点没有发生突变㊂2.3.6内部片段基因遗传进化分析将分离株的内部片段基因(P B2㊁P B1㊁P A㊁N P㊁M和N S基因)进行遗传进化分析,绘制进化树㊂分离株的P B2㊁P B1㊁P A㊁N P和M基因遗传进化分析结果显示,均来位于p d m/09H1N1分支㊂而N S基因处于北美三源重组分支(图5)㊂通过对分离毒株A/ s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022(H1N1)的8个基因节段的序列分析发现,该毒株的HA和N A基因来源于E A H1N1分支,P B1㊁P B2㊁P A㊁N P和M基因来源于p d m09H1N1分支,N S基因来源于t r H1N2(N o r t hA m e r i c a n t r i p l e r e a s s o r t a n tH1N2)分支,这属于近几年流行的G4基因型E A H I N1 S I V㊂3讨论S I V可引起猪的高度传染性呼吸系统疾病,发病率高,传播速度快,使患病猪生产性能下降㊂此外,其对人类也有一定的感染性[15]㊂S I V的一个显著特性是通过不断的变异和进化来逃避宿主的免疫保护,从而引发新的流感暴发和流行㊂S I V的持续进化不仅改变了其毒力,还引发了更广泛的猪流感流行,严重威胁了公共卫生安全[16-17]㊂流感病毒H A蛋白受体结合区的特殊氨基酸位点是决定其宿主范围的关键因素,H1亚型流感病毒唾液酸受体结合能力一般取决于第190和225位氨基酸,分离株A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/ 2022(H1N1)中HA基因第190和225位氨基酸分别为D㊁E,第226位氨基酸为Q,表明其既具备结合S Aα-2,6-G a l型人流感病毒S A受体的特点,也有结合S Aα-2,3-G a l型禽流感病毒S A受体的可能[18]㊂A型流感病毒P B2蛋白上的627和701位点是影响病毒致病性的关键位点,如发生E627K或D701N突变会显著提高病毒毒力[19],本试验分离毒株未发现这两个位点的突变㊂本试验中,S I V P B2蛋白的T271A㊁A590S和A591R的组合发生突变,有研究表明,这有利于S I V在哺乳动物宿主中的复制效率和毒力[20]㊂P B2蛋白中单个氨基酸T431M 发生突变,该氨基酸的突变对于E A H1N1亚型S I V在小鼠体内的毒力中起着关键作用,会显著增强E A H1N1亚型S I V在小鼠中的毒力[21]㊂分离株的P B1蛋白氨基酸位点H436Y和P A蛋白P224S位点发生相同的突变,这2个位点的突变有助于增强病毒在小鼠身上的毒力[22]㊂N P蛋白中K319N㊁Q357K位点突变,同样表明增强了对小鼠的致病性[23]㊂M基因的V27A㊁A30T㊁D44A位点发生突变,提示分离株可能对金刚烷胺类药物耐药性增加[24]㊂G4基因型S I V自2016年以来在中国逐渐形成流行趋势,主要在猪群中传播[25]㊂该基因型毒株是来源于3种谱系的重排方式,包括E A H1N1㊁p d m/09H1N1病毒,以及综合了禽类㊁人类和猪的流感病毒基因的北美三源重组t r H1N2病毒,中国南方地区生态㊁地理和气候环境独特,猪场㊁鸡场密集及人和畜禽的频繁接触,有利于S I V的变异和流行[26]㊂分离毒株基因片段HA㊁N A与来自E A H1N1亚型S I V相似性较高,部分基因片段与p d m/09H1N1相似性较高,与北京㊁安徽㊁辽宁等省份的片段高度同源,提示分离株可能是在人流感病毒感染猪及生猪跨区域流动过程中重排产生㊂随着S I V的变异和与其他亚型病毒的重组,其跨种间传播的能力和感染人的风险也逐步增强㊂因此,加强对华南地区S I V的监测对公共卫生具有重要意义㊂对于养猪业来说,要采取有效的预防和控制措施,如定期消毒㊁加强饲养管理㊁提高猪群的免疫力等,以减少猪流感的发生和传播㊂74618461中国畜牧兽医51卷A~F,分别为P B1㊁P B2㊁P A㊁N P㊁M和N S基因A-F,P B1,P B2,P A,N P,M a n d N S g e n e s,r e s p e c t i v e l y图5内部片段基因进化树F i g.5P h y l o g e n e t i c t r e e o f i n t e r n a l f r a g m e n t s4期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析4结论本研究分离到1株G4型欧亚类禽猪流感病毒(H1N1),将其命名为A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/ 2022(H1N1)㊂HA基因裂解位点氨基酸序列为P S I Q S R/G L具有低致病性流感病毒的分子特征,但在不同基因片段的关键氨基酸位点上发生了突变,这可能增强毒力和对哺乳动物的致病性㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]黄良宗,颜广智,邓汝森,等.猪流感病毒广东株分离鉴定及遗传进化分析[J].中国畜牧兽医,2020,47(8):2625-2633.HU A N GLZ,Y A N GZ,D E N G RS,e t a l.I s o l a t i o n,i d e n t i f i c a t i o na n d g e n e t i ce v o l u t i o na n a l y s i so fS w i n ei n f l u e n z av i r u sf r o m G u a n g d o n g p r o v i n c e[J].C h i n aA n i m a l H u s b a n d r y&V e t e r i n a r y M e d i c i n e,2020,47(8):2625-2633.(i nC h i n e s e)[2]I T O T,C O U C E I R O J N,K E l M S,e t 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动物医学进展,2021,2(1):6-12ProgressinVeterinary Medicine济南市犬瘟热病毒H基因遗传进化分析王召阳，蒋亚君，刘雪婷，侯绍华，郭晓宇，鑫婷，朱鸿飞，贾红（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193）摘要：为了解济南市犬瘟热病毒（CDV）的流行情况，通过随机采集7份济南市2019年1月一6月份宠物医院疑似感染CDV的临床样品，提取病毒RNA，扩增CDV H基因全长序列，连接至载体，测序后进行H基因序列的氨基酸及核苷酸同源性分析、进化树分析、主要氨基酸位点突变分析以及H基因抗原表位预测分析。

结果显示，7个野毒株均为Asia-I型，H基因核苷酸同源性为9&7%〜99.9%，氨基酸同源性为9&7%〜100%，与疫苗株相比差异较大，核苷酸、氨基酸同源性分别为90.0%〜90.9%和8&8%〜91.4%。

主要氨基酸位点突变分析表明，除SD-07为8个潜在天冬酰胺糖基化位点，其余6株均为9个潜在天冬酰胺糖基化位点。

H基因抗原性预测分析表明，7个野毒株与疫苗株相比存在明显的差异。

研究结果表明，济南市犬瘟热病毒株以Asia-I型为主，野毒株同源性与疫苗株相比差异较大，不同毒株间存在遗传多样性。

关键词：犬瘟热；犬瘟热病毒；H基因；序列分析中图分类号:S852.659.5；S85&292文献标识码:A文章编号：1007-5038（2021）01-0006-07犬瘟热（Canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的一种急性、高度接触性传染病［1］o CDV可引起多种食肉动物感染，发病率高，致死率高达50%2,严重威胁犬只健康。

犬瘟热也对其他野生动物，包括东北虎⑶、大熊猫、狮子、猕猴口5等造成严重威胁。

临床症状主要包括眼鼻分泌物增多、双相热、腹泻、呕吐、足垫增厚和抽搐等［1'6］，且CDV常与其他病原（犬细小病毒、犬冠状病毒虫和滴虫等）共同感染卩8。