最新《细胞工程》第4章3：动物细胞培养工程4

实验四动物细胞传代培养一、实验目的1.掌握消化法细胞传代培养的原理。

2.了解细胞传代培养所需专用设备、试剂。

3.学习细胞传代培养操作。

二、实验原理动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。

这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。

80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。

消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。

三、主要仪器与试剂1.实验仪器：改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、抽滤装置、超纯水器、倒置显微镜、二氧化碳培养箱2.实验试剂及材料：PE液、0.25%胰蛋白酶液、MEM+10%小牛血清液、原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞四、实验步骤1.用75%酒精消毒双手、工作台面、培养瓶、瓶盖、试管，并过火焰。

2. 从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器，过火焰后吸取2mlPE，于侧壁加入，轻摇后倒掉。

3.再加入5ml PE于侧壁，轻摇4-5min，于镜下观察，倒掉。

4.加入0.3ml 胰酶，扭紧瓶盖，观察，并轻拍。

5.大部分细胞脱壁后加入5mlMEM(含10%血清)，吹打形成细胞悬液。

6.将2ml细胞悬液移至玻璃培养瓶中，并取3ml MEM，加1ml MEM于玻璃培养瓶中，另外2mlMEM加入到塑料培养瓶中，过火焰，扭紧瓶塞。

7.在瓶壁上做标记。

8. 将传代好的培养瓶放置于37度二氧化碳培养箱中培养。

五、实验结果细胞由刚传代好时的圆球型（游离期）→贴附（贴壁期）→伸展（铺展）→细胞扁平或呈梭型→繁殖六、思考题1.请结合实验体会简述细胞传代培养成功的标志和显微镜下观察到的现象。

（消化前后、游离期、贴壁期、指数生长期等不同时期细胞状态、培养液的清澈度、颜色、细胞界限等），并比较成功与不成功培养及其他培养状态的差别。

《动物细胞工程》细胞工程揭秘在当今生物科学的前沿领域，动物细胞工程无疑是一颗璀璨的明星。

它宛如一把神奇的钥匙，为人类打开了探索生命奥秘和解决诸多现实问题的大门。

那么，什么是动物细胞工程呢？简单来说，动物细胞工程是以动物细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖、改造和应用的一门技术。

这门技术涵盖了多个方面，包括细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植等等。

细胞培养是动物细胞工程的基础。

想象一下，在一个无菌、恒温、营养充足的环境中，让细胞能够茁壮成长，如同在一个精心打造的“细胞乐园”里。

科学家们会根据不同细胞的特点，为它们调配出专属的“营养液”，提供最适宜的生长条件。

通过细胞培养，我们可以获得大量的细胞，用于各种研究和应用。

比如，生产疫苗、研究细胞的生理特性和疾病机制。

细胞融合则是让不同类型的细胞“携手合作”。

就好像把两个不同的拼图块拼接在一起，形成一个全新的、具有特殊功能的“拼图”。

通过细胞融合技术，我们可以将具有不同优点的细胞组合在一起，创造出具有更强大功能的细胞。

比如，将产生抗体的淋巴细胞和能够无限增殖的骨髓瘤细胞融合，得到既能产生抗体又能大量繁殖的杂交瘤细胞，用于制备单克隆抗体。

细胞核移植更是一项令人惊叹的技术。

它就像是给细胞进行一场“换芯手术”。

将一个细胞的细胞核取出，植入到另一个去核的细胞中，从而改变细胞的遗传特性。

最著名的例子就是克隆羊多利的诞生。

多利的出现让人们对生命的复制和遗传的操控有了全新的认识。

胚胎移植也是动物细胞工程的重要组成部分。

它就像是一场精心安排的“生命接力赛”。

将在体外培养好的胚胎，移植到雌性动物的子宫内，让其继续发育。

这项技术在畜牧业中有着广泛的应用，可以大大提高优良品种的繁殖效率。

动物细胞工程的应用领域十分广泛。

在医学领域，它为疾病的诊断和治疗带来了新的希望。

通过细胞工程技术生产的单克隆抗体，可以精准地识别和结合病变细胞，用于疾病的诊断和治疗。

例如，在癌症治疗中，单克隆抗体可以特异性地靶向肿瘤细胞，将药物准确地输送到病变部位，提高治疗效果，减少副作用。

第四章细胞培养1、培养细胞分为：贴壁型和悬浮型。

2、细胞培养培养基可分为天然培养基和合成培养基。

3、细胞培养包括原代培养和传代培养。

4、原代培养：指细胞或组织离开有机体之后的首次培养。

5、传代培养：培养细胞生长到一定密度后就需要更换新的培养液，这就是细胞的传代培养。

细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代或再培养。

6、细胞培养的基本方法有：悬滴培养法、培养瓶培养法、旋转管培养法。

7、常用培养技术有：二倍体培养、克隆培养、同步化培养、大规模培养。

8、原代培养的细胞一经传代就称之为细胞系，是一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。

细胞系经过进一步的克隆化，便得到由单一细胞组成的细胞群体称之为细胞株。

9、动物的细胞与组织培养是从动物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。

10、1907年Harrison采用淋巴液做培养基，培养蛙胚神经组织生活了数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，创立了在体外观察和研究活组织的方法。

1912年Carrel发现鸡胚胎抽取液有促进细胞生长的作用。

11、贴附包括细胞与细胞之间的相互接触和细胞与细胞外基质之间的相互接触两种方式。

12、根据体外培养细胞在支持物上贴附生长时的形态，大致分为如下四种类型：上皮细胞型、成纤维细胞型、游走细胞型、多形型细胞。

13、培养细胞的生长特点：贴附、接触抑制（由细胞接触而抑制细胞运动的现象，是区别正常细胞与癌细胞标志之一）密度抑制。

14、细胞周期：指一个母细胞分裂结束后形成的细胞至下一次再分裂结束形成两个子细胞的时期，可分为G1期、S期、G2期和M期。

15、细胞系生长阶段包括：原代培养期（指从体内取出组织接种培养到第一次传代的阶段）、传代期（将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个过程叫传代）、衰退期（转化的标志之一是细胞获得永久性增殖能力，成为连续细胞系）16、每代细胞一般要经过三个生长阶段：（1）潜伏期、（2）指数生长期、（3）停止期。

《动物细胞工程》讲义一、动物细胞工程的定义和范围动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，在细胞水平上进行的遗传操作以及细胞和组织培养技术，以改造细胞、创造新的生物品种或生产生物产品的一门综合性科学技术。

其范围涵盖了细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植、细胞重组、转基因动物等多个方面。

二、动物细胞培养技术（一）基本原理细胞培养是动物细胞工程的基础，其原理是细胞具有分裂和生长的能力。

在适宜的条件下，细胞可以不断增殖并保持一定的生理特性。

（二）培养条件1、无菌环境：防止微生物污染是细胞培养成功的关键。

2、合适的培养基：包含细胞生长所需的营养物质，如氨基酸、维生素、无机盐等。

3、适宜的温度和 pH：一般来说，培养温度在 37℃左右，pH 在 72 74 之间。

4、气体环境：通常需要 95%的空气和 5%的二氧化碳，二氧化碳用于维持培养基的 pH 稳定。

（三）培养过程1、取材：从动物体内取出组织或器官，进行处理以获得单细胞。

2、原代培养：将获得的细胞直接培养，这是细胞培养的第一代。

3、传代培养：当原代培养的细胞生长到一定密度时，进行分瓶培养。

（四）应用1、生物制品的生产，如疫苗、抗体等。

2、细胞生物学和分子生物学的研究。

3、药物筛选和毒性测试。

三、细胞融合技术（一）原理细胞融合是指两个或多个细胞通过物理、化学或生物方法融合成一个杂种细胞的过程。

其原理基于细胞膜的流动性。

（二）方法1、病毒诱导融合：使用某些病毒，如仙台病毒，促使细胞膜融合。

2、化学诱导融合：常用的化学试剂有聚乙二醇（PEG）。

3、电融合：通过电场作用使细胞排列紧密接触，进而融合。

（三）应用1、单克隆抗体的制备：将免疫小鼠的 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，分泌单克隆抗体。

2、细胞遗传和细胞免疫的研究。

四、细胞核移植技术（一）原理细胞核移植是将一个细胞的细胞核移植到另一个去核的细胞中，使其发育成一个新的个体。

这基于细胞核的全能性，即细胞核包含了生物体发育所需的全部遗传信息。