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实验四动物细胞传代培养一、实验目的1.掌握消化法细胞传代培养的原理。
2.了解细胞传代培养所需专用设备、试剂。
3.学习细胞传代培养操作。
二、实验原理动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。
这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。
80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。
消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。
三、主要仪器与试剂1.实验仪器：改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、抽滤装置、超纯水器、倒置显微镜、二氧化碳培养箱2.实验试剂及材料：PE液、0.25%胰蛋白酶液、MEM+10%小牛血清液、原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞四、实验步骤1.用75%酒精消毒双手、工作台面、培养瓶、瓶盖、试管，并过火焰。
2. 从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器，过火焰后吸取2mlPE，于侧壁加入，轻摇后倒掉。
3.再加入5ml PE于侧壁，轻摇4-5min，于镜下观察，倒掉。
4.加入0.3ml 胰酶，扭紧瓶盖，观察，并轻拍。
5.大部分细胞脱壁后加入5mlMEM(含10%血清)，吹打形成细胞悬液。
6.将2ml细胞悬液移至玻璃培养瓶中，并取3ml MEM，加1ml MEM于玻璃培养瓶中，另外2mlMEM加入到塑料培养瓶中，过火焰，扭紧瓶塞。
7.在瓶壁上做标记。
8. 将传代好的培养瓶放置于37度二氧化碳培养箱中培养。
五、实验结果细胞由刚传代好时的圆球型（游离期）→贴附（贴壁期）→伸展（铺展）→细胞扁平或呈梭型→繁殖六、思考题1.请结合实验体会简述细胞传代培养成功的标志和显微镜下观察到的现象。
（消化前后、游离期、贴壁期、指数生长期等不同时期细胞状态、培养液的清澈度、颜色、细胞界限等），并比较成功与不成功培养及其他培养状态的差别。
《动物细胞工程》讲义一、动物细胞工程的概述动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，在细胞水平上进行的遗传操作，以获得人们所需要的生物产品或细胞本身。
它是现代生物技术的重要组成部分，涵盖了细胞培养、细胞融合、细胞核移植、染色体工程、胚胎工程等多个领域。
动物细胞工程的发展为生命科学研究、医学治疗、农业生产等诸多方面带来了重大的变革和突破。
通过对动物细胞的深入研究和操控，我们能够更好地理解生命的奥秘，解决许多实际问题。
二、动物细胞培养（一）原理动物细胞培养的原理是细胞的增殖。
细胞在适宜的培养条件下，能够不断分裂和生长，形成细胞群体。
（二）培养条件1、无菌、无毒的环境：这是细胞培养成功的关键。
需要对培养环境、培养基和培养用具进行严格的灭菌处理。
2、营养物质：包括糖、氨基酸、无机盐、维生素等，需要保证其种类和含量适宜。
3、适宜的温度和 pH：一般来说，哺乳动物细胞培养的温度多在365℃左右，pH 在 72 74 之间。
4、气体环境：细胞培养需要一定的气体环境，其中 O₂用于细胞呼吸，CO₂用于维持培养液的 pH。
（三）培养过程1、取材：从动物体内取出相关组织，通常选用胚胎或幼龄动物的器官或组织，因为它们的细胞分裂能力更强。
2、分散细胞：使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶等处理组织，使其分散成单个细胞。
3、原代培养：将分散的细胞接种到培养瓶中，让其贴壁生长。
4、传代培养：当细胞长满培养瓶壁时，需要将细胞分成若干份，重新接种到新的培养瓶中继续培养。
（四）应用1、生物制品的生产：如疫苗、抗体等。
2、医学研究：用于疾病机制的研究、药物筛选等。
3、细胞治疗：例如，利用培养的免疫细胞进行肿瘤治疗。
三、动物细胞融合（一）概念动物细胞融合是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
（二）诱导融合的方法1、物理法：如电激法。
2、化学法：常用的诱导剂是聚乙二醇（PEG）。
3、生物法：如使用灭活的病毒。
（三）应用1、制备单克隆抗体：这是动物细胞融合最突出的应用。
第十章动物染色体工程动物染色体倍性改造：染色体倍性改造工程是指有目的、有计划地增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动植物新品种的一项染色体工程技术，主要包括多倍体育种和单倍体育种。
染色体加倍技术：1、化学诱导方法：（1）秋水仙素：秋水仙素能抑制和破坏纺锤丝的形成。
因此，用秋水仙素处理正在分裂的细胞，可使染色体正常复制而细胞不发生分裂，从而形成同源多倍体的细胞。
（2）细胞松弛素B：通过抑制动物的肌动蛋白聚合成微丝，阻止细胞质的分裂。
（3）麻醉剂N2O等。
2、物理诱导法：（1）温度休克法：包括略低于致死温度的冷休克法(0～5℃)和略高于致死温度的热休克法(30℃左右)两种。
温度休克法廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段。
它受三个因素的制约：温度处理的开始时间,即受精后的时间(TA)处理持续时间(D)处理温度(T)。
（2）水静压法:采用较高的水静压(65 kg／cm。
)来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。
（3）高盐高碱法.3、生物学方法生物学方法主要是通过杂交方法，尤其是种间或不同属、科间的远缘杂交，使染色体加倍，也称为染色体组的合并技术。
如狮子和老虎杂交，马和驴杂交。
多倍体的倍性鉴定:1、直接法：（1）染色体计数法：染色体计数是鉴定多倍性的一个准确的直接方法，但比较费时。
质量好的染色体标本可以从胚胎获得，因为胚胎细胞分裂指数高。
（2）DNA含量测定：流式细胞仪(flow cytomety)可以简单、快速及准确测定单细胞DNA含量，从而确定细胞的倍性。
2、间接法：（1)细胞体积测量：按照一般规律，细胞大小与染色体数目成比例增加，而且为维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。
但多倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。
红细胞体积测量简便易行。
（3）蛋白质电泳（3）生化分析：二倍体和三倍体的血液成分和细胞组成比例不一样。
动物多倍体育种的意义：（1）诱导的多倍体动物多数都具有良好的生长率（2）低等动物(如鱼类等)的种间杂交优势也非常明显。
