苯酚_硫酸法的改进发展

多糖是一类结构复杂的高分子化合物，其诸多生物活性引人关注，由于多糖结构复杂，不同种类多糖的分子组成和相对分子质量各不相同，目前国家对其含量测定方法还没有统一标准[1]，较为常用的为蒽酮-硫酸比色法和苯酚-硫酸比色法。

苯酚-硫酸比色法是Dubois M等[2]在1951年提出并建立的一种用于多糖含量测定的方法，也被称为苯酚-硫酸分光光度法或苯酚-硫酸法，其应用广泛。

具体方法是待测定多糖样品液1mL，加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀后迅速加入浓硫酸5mL，再次迅速摇匀，然后置沸水浴加热30min，冷水迅速冷却至室温，按分光光度法在490nm波长处测定吸光度值。

该法操作简便，快捷灵敏，且不需贵重仪器，但准确性和重现性受实验条件影响较大，其原理是利用多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，进而和苯酚缩合成有色化合物，在490nm处进行比色测定。

由于实验中加入硫酸的速度等操作因素因人而异，条件极不稳定，系统温度相差很大，对显色效果影响也很大。

因此，许多学者从不同角度对苯酚-硫酸法进行了大量研究改进，并有学者在此基础上建立了新的测定方法。

本文对苯酚-硫酸法主要改进方法进行了分类，现综述如下：1显色方式的优选徐光域等[1]针对苯酚-硫酸法实验过程中的温度问题进行了研究，提出了配制显色液的方法，即：将50mL浓硫酸缓缓加入10mL水中，冷却至室温，加入0.6g苯酚晶体，搅拌使其溶解配成显色液。

实验过程中待测样品直接加入显色液，其余均同传统苯酚-硫酸法。

该改进方法将硫酸、水和苯酚配制成显色液后再加至样品液中，减小了传统苯酚-硫酸法直接加入浓硫酸时引起的操作误差和温度对显色的影响，很好的解决了检测的重现性和准确度。

该实验中还对改进方法进行了实用性考察，通过对纯化的银耳多糖、可溶性淀粉猪苓多糖和海带多糖，以及对猪苓与海带水溶性混合物等多种样品的多糖进行了含量测定，结果证明该方法既简化了操作，又提高了精密度和准确性，具有较宽的实用范围。

王丽君[3]测定龙芽楤多糖含量时采用了上述配制显色液的方法，结果验证了该改进方法操作简单，准确度高，灵敏性好。

罗毅等[4]采用正交试验对苯酚-硫酸法的显色方式进行了优选，考察了影响显色的几个重要因素，如5%苯酚液用量、硫酸用量、水浴温度和反应时间，以显色后于490nm处测得的吸收值大小为指标，其结果表明，苯酚和浓硫酸的用量、反应温度和时间对测定结果的影响并无显著意义，实验时保证苯酚液为新鲜配制、硫酸和苯酚液的加入量精确、反应温度和时间恒定，平行操作，即能得到重现性好且准确可靠的测定结果。

该实验结果最后所优选的显色方式仅在硫酸加入量上与传统苯酚硫酸法略有差别，着重于通过稳定人为操作来减小实验误差。

2比色方法的选择苯酚硫酸法采用分光光度法进行比色测定，每第25卷第6期2011年11月天津化工Tianjin Chemical IndustryVol.25No.6Nov.2011苯酚-硫酸法的改进发展王超，张曜武（青岛科技大学化工学院，山东青岛266042）摘要：本文主要对苯酚-硫酸法的改进发展过程进行了综述。

该法测定多糖含量简便快捷，应用广泛，但也存在部分缺点，诸多学者对其进行了研究改进以更加准确的测定多糖含量。

关键词：苯酚-硫酸法；改进；多糖；含量测定doi:10.3969/j.issn.1008-1267.2011.06.006中图分类号：O652.63文章编号：1008-1267（2011）06-0016-03文献标志码：A收稿日期：2011-03-14作者简介：王超（1986-），女，硕士研究生。

张曜武，男，副教授，研究方向:中药制剂现代化。

第25卷第6期批一般最多只能测定三、四个样品，较为费事费时、损失样品较多。

商澎等[5]针对这些缺点，改用酶联免疫测定仪进行比色测定，其样品用量较少，仅为0.15 mL，在多糖分离制备时目标产物损失较少，而分光光度法需1~3mL。

该方法还采用细胞培养板替代分光光度计比色杯，使每个样品点的测定时间缩短到1~2s，大大节省了实验时间，减少了由于实验时间过长可能造成的误差。

虽然酶标仪测定结果的敏感性、相关性均不如分光光度计的测定结果，但可用于色谱分离后多糖组分的快速测定。

苏颖等[6]也采用了全波长酶标仪快速测定虫草多糖含量。

另外，商澎等[5]在测定多糖组分的同时,采用Serva blue G染料结合法还可快速测定多糖组分中的蛋白质。

3校正系数或换算因子的应用苯酚硫酸法测定多糖含量时，多用葡萄糖溶液作为标准液测得标准工作曲线，进而计算多糖含量。

由于不同单糖制得的标准曲线不完全相同，若单纯用葡萄糖做标准计算多糖含量必然存在一定误差。

董群等[7]用杂多糖或寡糖的组成单糖，相对于葡萄糖的校正系数及组成单糖的重量百分含量计算杂多糖或寡糖的含量，一定程度上减小了误差，但此方法要求知道杂多糖的准确组成。

钱和等[8]和徐斌等[9]在实验中分别利用精制芦荟多糖和苦瓜多糖计算相对葡萄糖的换算因子，一方面避免了用葡萄糖做标准引起的系统误差,另一方面较之根据杂多糖组成计算校正系数或用与杂多糖组成相同的混合单糖制作标准曲线简单，此方法平均回收率分别高达98.5±2.2%和98.38%，可在常规实验条件下实施，较适用于芦荟制品或苦瓜制品生产企业的常规检测。

采用校正系数或换算因子来提高苯酚-硫酸法的准确性是目前多糖含量测定时最常用到的方法，例如刘立超等[10]测定了栀子水溶性多糖的含量，马猛华等[11]测定了玫瑰花渣中的多糖含量，钟岩等[12]测定了鲜人参中的多糖含量等。

4差示酚硫法贺福元等[13]在2006年提出并建立了差示酚硫法，该法是对传统酚硫法的重大改进，不必经繁琐的分离纯化即可测量中药制剂中多糖含量，操作简捷、快速、精密度较高，有重大意义。

其优点是引入差示对多糖进行测定，可减少与多糖混在一起的其它非糖成分的干扰，不必对粗品多糖进行繁琐精制即可直接测定，但其基本方法还是沿用传统方法，仍有显色温度、时间等影响显色效果和系统稳定的因素的存在。

5改良-差示酚硫法[14]笔者在传统酚硫法、改良酚硫法和差示酚硫法的基础上，进行了大量实验研究，建立了一种新的测定多糖含量的方法：改良-差示酚硫法，弥补了上述方法的缺陷，结合了几者的优点，减少了样品中非糖杂质的干扰，不必对粗品多糖样品进行繁琐精制即可直接测定，且操作简便，具有较好的实用价值。

在研究改良-差示酚硫法的过程中，我们提出了相对吸收系数的定义，相对吸收系数=吸光度ΔA×稀释倍数/样品质量。

相对吸收系数表示的是单位质量样品的显色后原液（未经稀释之前的）的吸光度值。

当该定义式中其它项相同时，样品质量数越大，其中的多糖含量越低；稀释倍数越大，样品中的多糖含量越高；在实际样品测定中，当多糖含量低时，测得相同吸光度所需多糖质量就大；当含量高的时候，测得相同吸光度所需稀释倍数就小。

由此可见，多糖样品测定中的实际规律与该定义式的表述一致。

通过比较相对吸收系数可为选择不同工艺条件提供比较直观的参考数据，便于筛选实验条件，简便实用，可在不使用标准曲线的情况下进行多糖含量高低的相对比较，避免了测定标准曲线或者计算换算因子等一系列的繁琐操作过程。

综上可知，以上诸多改进方法均有重要意义，为苯酚-硫酸法的改进和发展提供了很有价值的参考。

当我们使用这些方法，采纳有关合理改进之后实验结果确有明显改观。

实验方法的研究和改进是无止境的，我们在实验过程中应善于发现问题进行改进，切忌熟视无睹。

参考文献：［1］徐光域,颜军,郭晓强,等.酸苯酚定糖法的改进与初步应用[J].食品科学，2005，26(8)：342-346.［2］Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et al.A colorimetric method for the d-etermination ofsugars[J].Nature,1951,28(7)：167-168.［3］王丽君.龙芽楤木多糖的提取及含量测定[J].北华大学学报（自然科学版），2008，9(3):217-219.［4］罗毅，潘细贵，刘刚，等.苯酚-硫酸法测定多糖含量显色方式的优选[J].制剂与工艺，2005，12(1)：45-46.［5］商澎，高蓉，梅其炳，等.苯酚硫酸法改用酶联免疫仪快速测定多糖组分[J].第四军医大学学报，2000，21(3)：27-29.［6］苏颖，周选围.改进苯酚-硫酸法快速测定虫草多糖含量[J].食品研究与开发，2008，29(3)：118-121.［7］董群，郑丽伊，方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含王超等：苯酚-硫酸法的改进发展17量的研究[J].中国药学杂志，1996，31(9)：550-552.［8］钱和，张添，刘长虹.改进苯酚-硫酸法测定芦荟多糖含量[J].江苏食品与发酵，2002，（109）：3-6.［9］徐斌，董英林琳，等.改良苯酚-硫酸法测定苦瓜多糖含量[J].食品科技，2005，2（12）：80-83.［10］刘立超，黄洪林，赖正权，等.苯酚硫酸法测定栀子水溶性多糖含量[J].安徽医药，2005，9(11):831-833.［11］马猛华，崔波，于海峰，等.苯酚硫酸法测定玫瑰花渣中多糖含量的研究[J].山东轻工业学院学报，2008，22(4):23-25.［12］钟岩，潘浦群，王艳红，等.苯酚硫酸法测定鲜人参中多糖含量[J].时珍国医国药，2008，19(8)：1957-1958.［13］贺福元，罗杰英，刘平安，等.差式酚硫法的建立及对五子衍宗颗粒剂中多糖测定比较研究[J].中医药导报，2006，12(1)：2-5.［14］王超，张曜武.改良-差示酚硫法的建立及对淫羊藿多糖的含量测定[J].西北药学杂志（已收录）.水溶液中的Cu （Ⅱ）在有氰根CN -存在的情况下，很容易被还原成Cu （Ⅰ），虽然C —Cu （Ⅱ）键联的Cu(II)的化合物在室温下不稳定，但是研究表明[1]选择具有很好的σ电子给予特性的配体，比如氨，吡啶，就可能稳定Cu （Ⅱ）—CN 配位键。

最近几年，含有Cu （Ⅱ）—CN 配位键的配合物陆续被报道[2]，给金属有机配合物的发展注入了新的活力。

而含有CN -桥连的Cu(Ⅰ)/Cu （Ⅱ）混合价配合物的文献报道[3]非常多，这种混价铜Cu （Ⅰ）/Cu （Ⅱ）配合物往往拥有非常奇特的结构，引起了化学工作者极大的兴趣。

在合成此类配合物的过程中，无论是通过Cu （Ⅰ）的氧化还是通过Cu （Ⅱ）的还原，选择合适的端基配体对于形成配合物新奇的结构以及配合物能否稳定存在有一定影响。

目前，以CN -桥连稳定的Cu （Ⅱ）/Cu （Ⅰ）混价配位聚合物的报道并不多见，本实验设计合成了一种CN －连接的稳定的Cu(Ⅰ)/Cu(Ⅱ)的混价配位聚合物，测定了它的晶体结构，并进行了光谱性质、电化学性质和磁学性质的研究。