酶工程的研究进展简述

收稿日期:2000-12-05作者简介:郑成(1955-),广东遂溪人,广州大学轻化系教授,博士生,主要从事酶生物工程与化学工程方面的研究与教学工作.酶工程的研究进展简述

郑　成

(广州大学生物与化工学院,广东广州,510091)

摘要:简述了酶工程的最新研究进展,其中包括人工合成酶和模拟酶,核酸酶与抗体酶,非水系酶,以及极端环境微生物和不可培养微生物的新酶种等.关键词:酶;酶工程;进展中图分类号:Q55　文献标识码:A 文章编号:1007-5348(2001)06-0039-06

酶工程是研究酶的生产和应用的一门新兴学科,它的应用范围已遍及工业、农业、医

药卫生行业、环保、能源开发和生命科学等各个方面.作为工业应用来说,主要目的就是

利用酶的催化作用,在较为温和的条件下,如低温、低压等,就可高效地将反应物转化为

产物.但目前工业上直接利用酶制剂时还存在一些缺点,如稳定性差、使用效率低,不能

在有机溶剂中使用,寿命不长等,造成了使用酶的成本升高.世界上围绕着解决这些问题

开展了大量的研究.本文通过查阅大量资料,对酶工程的研究发展进行简述.

1　人工合成酶和模拟酶[1～2]

人工合成酶在结构上具有两个特殊部位,一个是底物结合位点,一个是催化位点.业

已发现,构建底物结合位点比较容易,而构建催化位点比较困难.2个位点可以分开设

计.但是已经发现,如果人工合成酶有一个反应过渡态的结合位点,则该位点常常会同时

具有结合位点和催化位点的功能.人工合成酶通常也遵循Michaelis2Menten方程.例如.高分子聚合物聚-4-乙烯基吡啶-烷化物,具有糜蛋白酶的功能,含辅基或不含辅基的

高分子聚合物,具有氧化还原酶、参与光合作用的酶和各种水解酶等功能.在模拟酶方面,固氮酶的模拟最令人瞩目.人们从天然固氮酶由铁蛋白和铁钼蛋白2种成分组成得到启发,提出了多种固氮酶模型.如过渡金属(铁、钴、镍等)的氮络合

物,过渡金属(钒、钛等)的氮化物,石墨络合物,过渡金属的氨基酸络合物等.此外,利用铜、铁、钴等金属络合物,可以模拟过氧化氢酶等.近来,国际上已发展起一种分子压印(molecularimprinting)技术,又称为生物压

印(bioimprinting)技术.该技术可以借助模板在高分子物质上形成特异的识别位点和催

化位点.目前,此项技术已经获得广泛的应用.例如,模拟酶可以用于催化反应,分子压

印的聚合物可用作生物传感器的识别单元等.

2　核酸酶和抗体酶[3～5]

近年来,人们发现除去蛋白质具有酶的催化功能以外,RNA和DAN也具用催化功

能.1982年Cech发现四膜虫的26SrNAD的前体,在没有蛋白质存在的情况下,能够进2001年6月韶关学院学报(自然科学版)Jun.2001第22卷　第6期JournalofShaoguanUniversity(NaturalScience)Vol.22　No.6行内含子的自我剪接,形成成熟的rRNA,证明RNA分子具有催化功能,并将其称为核

酸酶(ridozyme,有人译为核酶).1995年Cuenoud又发现某些DNA分子也具有催化功

能.这就改变了只有蛋白质才具有催化功能的传统观念,也为先有核酸,后有蛋白质提供

了进化的证据.进一步的研究发现核酸酶的一种多功能的生物催化剂,不仅可以作用于RNA和

DNA,而且还可以作用于多糖、氨基酸酯等底物.核酸酶还可以同时具用信使编码功能

和催化功能,实现遗传信息的复制、转录和翻译,是生命化过程中最简单、最经济、最原

始的、催化核酸自身复制和加工的方式.核酸酶具有核酸序列的高度特异性.这种特异性

使核酸酶具有很大的应用价值.只要知道某种核酸酶的核苷酸序列,就可以设计合成催化

其自我切割和断裂的核酸组成.根据这些基因组的全部序列,就可设计并合成出防治有这

些病毒引起的人、畜和植物病毒病的核酸酶,如能够防治流感、肝炎、艾滋病和烟草花叶

病等.核酸酶也可以用来治疗某些遗传病和癌病.核酸酶还可以用作研究核酸图谱和基因

表达的工具.一般说来,人工合成的模拟酶与天然酶的催化效率相差较大,而且,反应类型大都为

水解反应.人们从酶与底物过渡态中间物紧密结合是酶催化过程中的关键一步得到启发,联想到抗原引起生物内抗体的合成,以及抗原和抗体紧密结合,进而考虑利用抗原抗体相

互作用的原理来模拟酶的催化作用.人们设想以一些底物过渡态中间物的类似物作为半抗

原,诱导合成与其构象互补的相应的抗体,试图得到能够催化上述物质进行活性反应的

酶.1986年这种努力在实验室里获得了成功,为人工合成酶和模拟酶,开创了一条崭新

的途径.人们将这种具有催化活性的抗体称为抗体酶(abzyme)又称催化抗体(catalytic

antibody).抗体酶在本质上是免疫球蛋白,人们在其易变区赋予了酶的催化活性.抗体是目前已知的最大的多样性体系,原始抗体大家族有1×108个结合部位,体细胞变异学

可以增加1×104个结合部位.抗体有极高的亲和力,解离常数为10-4～10-14mol/L,其

与抗原结合的结合部位与酶的结合部位相似,但无催化活性.制备抗体酶的方法主要有诱

导法、拷贝法、插入法、化学修饰法和基因工程法.抗体酶的催化效率远比模拟酶高.同时,从原理上讲,只要能找到合适的过渡态类似

物,几科可以为任何化学反应提供全新的蛋白质催化剂———抗体酶.目前抗体酶催化的反

应、闭环反应,还能催化合成反应、交换反应、闭环反应、异构化反应、氧化还原反应

等.此外,与模拟酶相比,抗体酶已经用于酶作用机理的研究,手性药物的合成和拆分,抗癌药物的制备.目前人们正致力于进一步提高抗体酶的催化效率,期望在深入了解酶的

作用机理,以及抗体和酶的结构和功能的基础上,能够真正按照人们的意愿,构建出具有

特定催化活性和专一性的、催化效率高的、能满足各种用途需要的抗体酶.

3　非水系酶[6～7]

酶反应通常在水为介质的系统中进行.但是,酶反应也能在非水系统内进行.1984年以来,美国麻省理工学院以Zaks和Klibanov教授为首的研究小组,一直从事非水系统

内酶反应的研究,取得了引人注目的成果,并由此产生了一个全新的分支学科———非水酶

学.他们发现这类反应具有如下特点:(1)绝大多数有机化合物在非水系统内溶解度很

高;(2)根据热力学原理,一些在水中不可能进行的反应,有可能在非水系统中进行;・04・韶关学院学报(自然科学版)2001年(3)与水中相比,非水系统内酶的稳定性比较高;(4)从非水系统内回收反应产物比水中

容易;(5)在非水系统内酶很容易回收和反复使用,不需要进行固定化.实验结果证明,在几乎没有水的系统内,仍可进行各种酶反应.例如,在含有

013mol/L丁酸和013mol/L庚醇的已烷中,可以进行脂及酶催化的酯化反应,2h后酯化率达90%以上.如果在水中进行酯化反应,酯化率为011%以下.此外,在非水系统内,还能进行酶催化的酰胺水解、酰基交换、硫酸根交换和肟水解等反应.众所周知,酶不能改变反应的平衡常数(Keq).但是,利用水-有机溶剂两相系统,可以引起实践上很有用的“表现”Keq很大的改变.前已述及,在非水系统内酶的稳定性

提高.水溶性更高、亲水性更强的酶的稳定性,似乎取决于微环境内存在水的薄层,大约

几个水分子厚.水的数量非常微小.每个酶分子需要50～500个水分子.酶也可以在几乎

完全无水的状态下起催化作用.在这样微小的、不含游离氢离子的环境中的pH,是无法

直接测量和控制的.然而,酶有一种“记忆”功能.当酶从水溶液中向有机溶剂中转移

时,似乎能够“记住”,即保留住它最后所处环境中的pH,以及在该pH的功能.如果酶

结合的水被除去,或被易于与水混溶的有机溶剂稀释,则酶一般会失去活性.但是,在不

发生失活的条件下,只要有极微量的水以及与之有关的水的活度的降低,会大大降低酶热

失活的速度.这一现象可以用于绝大多数酶.例如,猪胰脏脂肪酶在含有0102%水的三

丁酸甘油酯内,100℃时的半衰期为12h;当水分为018%时,凌晨衰期下降到12min.而

在100%的水中,酶将立即失活.此外,在水-有机溶剂两相系统内,水的冰点下降,这

样,就可以在非常低的温度下,使用对热特别不稳定的酶.降低水的活度可以使酶分子更

具有刚性,这就可能影响到酶的Km和Vmax.在极端情况下,可能引起酶的催化功能的改

变.以往,人们都是从酶的最适pH的水溶液中回收酶.然后,将其研磨成粉末.再分散

在合适的有机溶剂中,制成酶的悬浮液,以便在水-有机溶剂两相系统中进行酶的催化反

应.近来Klibanov为首的研究组又探索出一种新方法,可以使酶溶解而不是悬浮在有机

溶剂中.而且,找到很多能够溶解酶有机溶剂,并阐明了导致有机溶剂中较高蛋白质浓度

的规律.由此,可以进一步研究溶解在有机溶剂中的天然酶的结构和催化特性.因而,必

将大大拓宽酶在非水系统中的应用范围.近来,核磁共振、x-射线衍射和傅立叶变换红外光谱的研究表明,在非水相中,酶

分子结构中α-螺旋含量减少,β-折叠含量增加,二级结构的有序性增加,因而,提高

了酶的稳定性.目前,非水系统中酶的催化作用已广泛地用于药物、生物大分子、肽类、

手性化合物化学中间体和非天然产物等有机合成,引起人们的极大的关注.

4　极端环境微生物和不可培养微生物的新酶种[8～9]

自然界蕴藏着巨大的微生物资源.据测算,1g土壤中含有1×108个微生物.美国华

盛顿大学的JamesStaley教授说过:“未知的微生物世界或许是地球上最大的未开发的自

然资源,能够利用这个微生物资源的国家,势必会取得技术上的优势.”

自Kuhne从希腊语借用“酶”(“en-zyme”)一词以来,随着研究工作的深入,酶的种

类在不断增加.迄今为止,还不知道自然界究竟有多少种酶.同样,也不清楚,每个细胞内究

竟有多少种酶.有人估计,大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞中有3000种蛋白质,而真核细胞・14・第6期郑　成:酶工程的研究进展简述中有50000种蛋白质.这些蛋白质中的大多数是酶.如果估计可靠,酶的种类将达到几万

种.近来,人们从生产实践的需要出发,非常重视开发新的酶种.迄今为止,人们对极端

环境微生物(ex2tremophiles)和不可培养微生物(unculturablemicroorganisms)的研究还很

不够.这2个资源宝库值得人们好好开发.人们首先注意从极端环境条件下生长的微生物内筛选新的酶种.其中主要研究嗜热微

生物(thermophiles)、嗜冷微生物(psy2chrophiles)、嗜盐微生物(halophiles)、嗜酸微生物

(acidophiles)、嗜碱微生物(alkalophiles)、嗜压微生物(barophiles)等.目前,人们已经发

现能够在250～350℃条件下生长的嗜热微生物,能够在-10～0℃条件下生长的嗜碱微生

物,能够在pH215条件下生长的嗜酸微生物,能够在pH11条件下生长的嗜碱微生物,能

够在饱和食盐溶液(含盐32%或512mol/L)中生长的嗜盐微生物,能够在1101×105kPa

条件下生长的嗜压微生物,以及在高温(105℃)和高压(41053×107Pa)条件下生长的

嗜热嗜压微生物等.这就为新酶种和酶的新功能的开发,提供了广阔的空间.其中人们对

嗜热嗜压微生物的研究最多,大量专著不断涌现.耐高温的α-淀粉酶和DNA聚合酶等