第十二 动物细胞的大规模培养技术
大规模培养哺乳类细胞是生产许多临床和医学上重要生物制品的一种有效的方法，这些生物制品包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单克隆抗体等，推动了生物学和医学的发展，给医学卫生事业带来了巨大的社会效益和经济效益。基因工程技术、细胞工程技术，以及新的细胞大规模繁殖培养系统的发展，是构成上述成就的主要原因。然而，体外大规模繁殖真核细胞要比原核细胞困难得多，如细菌、酵母菌和霉菌的细胞壁厚，能耐受搅拌，不易破碎，营养要求低，生长条件易于控制，增殖周期短，产品的产量也高，目前国外已用20万L发酵罐进行生产。而真核细胞膜薄而娇嫩、易碎，对营养要求高，大多数细胞必须贴壁附着生长，更重要的是真核细胞具有原核细胞所没有的功能，能对其分泌产物进行修饰，例如二硫键的形成、糖甲酰化等，使产物具有完整的生物学功能，另外原核细胞经基因工程技术所合成的生物制品，不是分泌型的而是同细胞相结合的，需要破碎细胞，释出产物，再经浓缩、纯化；因后加工过程复杂，而使产品的得率受到损失。利用真核细胞，可以不断合成和分泌，不断收获，后加工过程也相对简单，而且细胞往往可以重复利用。因此，利用培养的动物细胞生产的生物制品，仍有很高的市场价值。
实验室常规培养动物细胞的方法是用人工合成培养液加上一定量的小牛血清，将细胞放在不同的容器中进行培养，如微孔板、培养皿以及各种培养瓶等。一船培养容器的体积很小，最大培养体积为1—2L。用这种方法培养的细胞所分泌的产物是有限的，无法满足实验研究和应用研究的需要。利用小鼠腹水法繁殖杂交瘤细胞生产各种单克隆抗体；虽然能获得较高浓度的单克隆抗体，一般每只小鼠腹水单克隆抗体浓度在10mg／m1左右，但不易控制动物的批间差异和非特异的小鼠免疫球蛋白，以及潜在感染因子的污染。单克隆抗体纯度差，分离纯化难度大，成本不低，又不宜用于人体内的诊断和治疗。因此，不可能作为大规模生产单克隆抗体的主要方法。
大规模培养细胞技术
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大规模培养细胞技术
摘要： 细胞培养工作始于20世纪初，现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为细胞与组织研究的重要技术之一。近年来，随着基因工程和细胞工程技术的不断发展，动物细胞培养已成为大规模生产一系列有商品价值的生物制品的重要宿主，当前人们已经能够生产多种单克隆抗体、激素、细胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等。但是，实验室采用的细胞培养技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求，必修改用超产培养技术方法方可获得大量细胞，目前这种技术种类繁多，归纳起来有三大类：①贴壁培养法；②悬浮培养法；③固定化培养法。细胞体外培养技术的不断发展和完善，为组织和器官培养以及现代生物技术前沿的转基因动物技术、克隆技术、干细胞定向分化、体外受精、性别控制等一系列技术的发展奠定了基础。
关键词：细胞培养；贴壁；悬浮；固定化
前言
动物细胞培养开始于本世纪初1962年，动物细胞培养规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，动物细胞培养已成为医药生物高技术产业的重要部分。利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。本文对细胞的培养工艺做一综述。
1.细胞培养的定义
细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤成纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无限制制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。 2.动物细胞培养的工艺
大规模培养技术应用简介
通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。20世界60-70年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培养技术（large-scale culture technology）是指在人工条件下（设定ph、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube等贴壁细胞培养，发展为生物反应器（Bioreactor）进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。
随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70年代以来，细胞培养用生物反应器有很大的发展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培养生物反应器有空气提升反应器，中空纤维管反应器，无泡搅拌反应器及篮式生物反应器等。八十年代以来，人们逐渐开始以生物反应器培养代替鼠腹水的方法获得单克隆抗体。
第4节 动物细胞培养
一 动物细胞培养类型
(一)细胞原代培养
1.取材分离 · 取出组织块放入小烧杯中，用尖嘴剪刀将组织
块剪碎成1mm3大小，加入Hanks液（平衡盐水
BSS） ，冲洗数次。 ·
Adult
Embryo
Egg
取材分离
Dissection
Enzyme Digestion
Cell Culture
Finely chopped
Primary Explants
Further dissection
if necessary Organ Culture 2.组织消化： ·是用酶法将剪碎的组织块分散成
细胞团或单细胞。
·将剪碎的组织块放人三角烧瓶中，
加人30～50倍体积的0.25％浓度
胰蛋白酶；
·消化：37℃水浴内消化30～60分
钟。
·过滤：如果大部分细胞已经分散，
终止消化，以不锈钢筛过滤
(100μm）滤除未被消化的组织块。
·离心：8000rpm/min离心5分钟，
弃上清液,沉淀为细胞。
·漂洗；Hanks液漂洗两次，每次
2～3分钟，加人营养液 。
3.细胞计数
·细胞悬液制成后，需要计数
悬液中细胞的浓度，通常以
细胞个数／ml表示。检查方
法如下：
·1）在干净的离心管中加人数滴
细胞悬液，再加人6.4％台盼蓝
（trypan blue）1滴，混匀后静
置2～3分钟；
·2）将计数板（如图）平放在显
微镜台上，在盖片边缘加人l～2
滴染色的细胞悬液，使之完全充
满计数板与盖片间的空间，勿留
气泡，勿使盖片漂浮； ·3）显微镜下记录计数板四角 四个大格中的细胞总数，原
