凝胶色谱(中国药典)
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0514分子排阻色谱法中国药典2015年版
件均应使用惰性材料，如聚醚醚酮（PEEK)等。也可使用一
般的高效液相色谱仪，只要其部件能与洗脱液和供试品溶液 相适应。仪器应定期检定并符合有关规定。(11色谱柱离子交换色谱的色谱柱填充剂有两种，分 别是有机聚合物载体填充剂和无机载体填充剂。有机聚合物载体填充剂最为常用，填充剂的载体一般为 苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚 物、聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯聚合物等有机聚合物。这类载 体的表面通过化学反应键合了大量阴离子交换功能基（如烷 基季铵、烷醇季铵等）或阳离子交换功能基（如磺酸、羧酸、
羧酸-膦酸和竣酸-膦酸冠醚等），可分别用于阴离子或阳离 子的交换分离。有机聚合物载体填充剂在较宽的酸碱范围 (pH 0〜14)内具有较髙的稳定性，且有一定的有机溶剂耐
受性。无机载体填充剂一般以硅胶为载体。在硅胶表面化学键
合季铵基等阴离子交换功能基或磺酸基、羧酸基等阳离子交 换功能基，可分别用于阴离子或阳离子的交换分离。硅胶载 体填充剂机械稳定性好、在有机溶剂中不会溶胀或收缩。硅 胶载体填充剂在pH 2〜8的洗脱液中稳定，一般适用于阳
离子样品的分离。(2)洗脱液离子色谱对复杂样品的分离主要依赖于色谱 柱中的填充剂，而洗脱液相对较为简单。分离阴离子常采用
稀碱溶液、碳酸盐缓冲液等作为洗脱液；分离阳离子常采用 稀甲烷磺酸溶液等作为洗脱液。通过调节洗脱液pH值或离 子强度可提高或降低洗脱液的洗脱能力；在洗脱液内加入适 当比例的有机改性剂，如甲醇、乙腈等可改善色谱峰峰形。 制备洗脱液的水应经过纯化处理，电阻率大于18Mn*cm。
使用的洗脱液需经脱气处理，常采用氦气等惰性气体在线脱 气的方法，也可采用超声、减压过滤或冷冻的方式进行离线 脱气。(3)检测器电导检测器是离子色谱常用的检测器，其
他检测器有安培检测器、紫外检测器、蒸发光散射检测 器等。电导检测器主要用于测定无机阴离子、无机阳离子和部 分极性有机物，如竣酸等。离子色谱法中常采用抑制型电导 检测器，即使用抑制器将具有较高电导率的洗脱液在进入检
测器之前中和成具有极低电导率的水或其他较低电导率的溶 液，从而显著提高电导检测的灵敏度。安培检测器用于分析解离度低、但具有氧化或还原性质
的化合物。直流安培检测器可以测定碘离子（r)、硫氰酸 根离子(scn_)和各种酚类化合物等积分安培检测器和脉
冲安培检测器则常用于测定糖类和氨基酸类化合物。紫外检测器适用于在高浓度氣离子等存在下痕量的溴离 子(Br-)、亚硝酸根离子（N02-)、硝酸根离子（NOr)以及 其他具有强紫外吸收成分的测定。柱后衍生-紫外检测法常
用于分离分析过渡金属离子和镧系金属离子等。原子吸收、光谱、原子发射光谱（包括电感耦合等离子体 原子发射光谱）、质谱（包括电感耦合等离子体质谱）也可作 为离子色谱的检测器。离子色谱在与蒸发光散射检测器或
• 62 •(和〉质谱检测器等联用时，一般采用带有抑制器的离子色谱 系统。2.样品处理
对于基质简单的澄清水溶液一般通过稀释和经0. 45^m 滤膜过滤后直接进样分析。对于基质复杂的样品，可通过微 波消解、紫外光降解、固相萃取等方法去除干扰物后进样 分析。3.系统适用性试验照高效液相色谱法（通则0512)项下相应的规定。4.测定法
(1)内标法(2)外标法(3>面积归一化法上述(1)〜（3)法的具体内容均同髙效液相色谱法（通则 0512)项下相应的规定。(4)标准曲线法按各品种项下的规定，精密称（量）取 对照品适量配制成贮备溶液。分别量取贮备溶液配制成一系 列梯度浓度的标准溶液。取上述梯度浓度的标准溶液各适量 注人色谱仪，记录色谱图，测量标准溶液中待测组分的峰面 积或峰高。以标准溶液中待测组分的峰面积或峰髙为纵坐标，
以标准溶液的浓度为横坐标，回归计算标准曲线，其公式为： Ar ~ x cr+h 式中AR为标准溶液中待测组分的峰面积或峰高；
CR为标准溶液的浓度； a为标准曲线的斜率；&为标准曲线的截距。
再取各品种项下供试品溶液适量，注入色谱仪，记录色 谱图，测量供试品溶液中待测组分的峰面积或峰高。按下式
计算其浓度：As—6cs =--------a式中As为供试品溶液中待测组分的峰面积或峰高；
cs为供试品溶液的浓度；<1、6符号的意义同上。上述测定法中，以外标法和标准曲线法最为常用。
0514分子排阻色谱法
分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的
一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱
柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经过修饰的 凝胶如葡聚糖凝胶（Sephadex)和琼脂糖凝胶（Sepharose)等
为填充剂，这些填充剂表面分布着不同孔径尺寸的孔，药物
分子进人色谱柱后，它们中的不同组分按其分子大小进人相
应的孔内，大于所有孔径的分子不能进人填充剂颗粒内部，
在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为
保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进人填充剂表面
的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较
长；其余分子则按分子大小依次被洗脱
。歌渝公ｌ郁蓄ｏｕｒｙａｏ ・ ｃｏｍ中国药典2015年版0521气相色谱法
1.对仪器的一般要求
分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱
法(通则0512>，液相色谱栗一般分常压、中压和高压泵。
在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中，通常采 用高效分子排阻色谱法（HPSEC)。应选用与供试品分子大
小相适应的色谱柱填充剂。使用的流动相通常为水溶液或缓 冲溶液，溶液的pH值不宜超出填充剂的耐受力，一般pH
值在2〜8范围。流动相中可加人适量的有机溶剂，但不宜
过浓，一般不应超过30%，流速不宜过快，一般为0.5〜
1. Oml/min。
2.系统适用性试验
分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数
(n)、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况 下，同高效液相色谱法（通则0512)项下方法，但在高分子
杂质检査时，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线
分离时，其分离度的计算公式为：
p_ 二聚体的峰高 单体与二聚体之间的谷高
除另有规定外，分离度应大于2.0。
3.测定法
(1)分子量测定法一般适用于蛋白质和多肽的分子量
测定。按各品种项下规定的方法，选用与供试品分子大小相
适宜的色谱柱和适宜分子量范围的标准物质，除另有规定 外，标准物质与供试品均需使用二硫苏糖醇（DTT)和十二
烷基硫酸钠（SDS)处理，以打开分子内和分子间的二硫键，
并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白质和多肽分 子通常以线性形式分离，以标准物质分子量（Mw)的对数值
对相应的保留时间（化）制得标准曲线的线性回归方程 lgMw=a+6«R，供试品以保留时间由标准曲线回归方程计
算其分子童或亚基的分子量。(2>生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法生
物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子
大小不均一的特点，故生物大分子聚合物分子量与分子量分
布是控制该类产品的关键指标。在测定生物大分子聚合物分
子量与分子量分布时，选用与供试品分子结构与性质相同或
相似的标准物质十分重要。按各品种项下规定的方法，除另有规定外，同样采用分 子量标准物质和适宜的GPC软件，以标准物质重均分子量
(AL)的对数值对相应的保留时间UR)制得标准曲线的线性
回归方程lgAiw=a+&R，供试品采用适宜的GPC软件处理
结果，并按下列公式计算出供试品的分子量与分子量分布。M^ZRIi/ZiRh/M,)
D=MW/M„
式中紙为数均分子量；
为重均分子量t
D为分布系数；为供试品在保留时间i时的峰高；
抓为供试品在保留时间i时的分子量。、
(3)高分子杂质测定法高分子杂质系指供试品中含有
分子量大于药物分子的杂质，通常是药物在生产或贮存过程
中产生的髙分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能产生过
敏反应的高分子物质。按各品种项下规定的色谱条件进行分离。
定量方法①主成分自身对照法同高效液相色谱法（通则0512)
项下规定。一般用于高分子杂质含量较低的品种。②面积归一化法同高效液相色谱法（通则0512)项下
规定。
③限量法除另有规定外，规定不得检出保留时间小于
标准物质保留时间的组分，一般用于混合物中高分子物质的
控制。④自身对照外标法一般用于Sephadex G-10凝胶色谱
系统中矛内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。在该分离系统
中，除部分寡聚物外，浐内酰胺抗生素中高分子杂质在色谱
过程中均不保留，即所有的髙分子杂质表现为单一的色谱
峰，以供试品自身为对照品，按外标法计算供试品中高分子
杂质的相对百分含量。
【附注】Sephadex G-10的处理方法
色谱柱的填装装柱前先将约15g葡聚糖凝胶Sephadex G-10 用水浸泡48小时，使之充分溶胀，搅拌除去空气泡，徐徐倾人
玻璃或其他适宜材质的柱，一次性装填完毕，以免分层，然 后用水将附着玻璃管壁的Sephadex G-10洗下，使色谱柱面
平整，新填装的色谱柱要先用水连续冲洗4〜6小时，以排
出柱中的气泡。
供试品的加入进样可以采用自动进样阀，也可以直接 将供试品加在床的表面（此时，先将床表面的流动相吸干或
渗干，立即将供试品溶液沿着色谱管壁转圈缓缓加人，注意
勿使填充剂翻起，待之随着重力的作用渗人固定相后，再沿 着色谱管壁转圈缓缓加人3〜5ml流动相，以洗下残留在色
谱管壁的供试品溶液）。
0521气相色谱法
气相色谱法系采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂
的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化
后，被载气带人色谱柱进行分离，各组分先后进人检测器，
用数据处理系统记录色谱信号。
1.对仪器的一般要求
所用的仪器为气相色谱仪，由载气源、进样部分、色谱
柱、柱温箱、检测器和数据处理系统等组成。进样部分、色
谱柱和检测器的温度均应根据分析要求适当设定。
(1)载气源气相色谱法的流动相为气体，称为载气，
氦、氮和氢可用作载气，可由高压钢瓶或高纯度气体发生器
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