基于COI基因序列的鱼类系统发育分析

中国近海石首鱼科鱼类DNA条形码及分子系统学研究石首鱼科(Sciaenidae)鱼类简称石首鱼类,在中国海洋渔业中占有重要的地位,其中大黄鱼(Larimichthys crocea)和小黄鱼(L.polyactis)位列中国的四大海产,黄唇鱼(Bahaba taipingensis)、褐毛鲿(Megalonibea fusca)等价值不菲,但近年来海洋捕捞、环境污染等问题使石首鱼科的一些种类数量剧减,甚至有些濒临灭绝。

迄今已报道的中国石首鱼类约有18属35种,因外部形态极为相似,且传统的分类鉴定多依据内部解剖特征,导致物种鉴定困难,目前系统发育关系仍存争议。

本文分析了中国近海石首鱼科18属34种269个体标准DNA条形码线粒体COI基因序列,并将测序的17种鱼的COI、Cytb和ND2基因全长序列与GenBank 下载的24种石首鱼的同源序列结合进行系统发育分析,旨在丰富中国石首鱼类DNA条形码数据库,探讨部分属种的有效性和系统发育关系,结果如下:基于DNA 条形码序列的系统树与ABGD分析一致分为32个分支,基于K2P模型的分支间平均遗传距离为0.239(0.0376~0.399),均大于2%阈值;分支内平均遗产距离为0.0026(0~0.014),均小于2%阈值;分支间平均遗传距离约为分支内的92倍,形成明显的DNA条形码间隙。

除单一序列物种形成的单种支外,其它28分支中有18个为单种支(64%),由多个物种混杂而成的分支占25%,而同一物种被分到不同分支(该物种布及的所有分支)达到25%;表明DNA条形码分析结果与传统形态分类存在一定差异,石首鱼类的形态分类较为混乱。

研究结果支持黑鳃梅童鱼(Collichthys niveatus)与棘头梅童鱼(C.lucidus)分为2个种的分类处理。

双棘原黄姑鱼(Protonibea diacanthus)可能经历了近期辐射进化或存在较高的多样性;褐毛鲿、斑点翼牙?(Pterotolithus maculatus)可能存在杂交现象、不完全谱系分选或人为错鉴;浅色黄姑鱼(Nibea coibor)与黑缘黄姑鱼(N.soldado)的关系还需进一步研究;DNA条形码未能有效鉴定日本银身?(Argyrosomus japonicus)和厦门银身?(A.amoyensis);叫姑鱼属(Johnius)可能普遍存在鉴定问题。

基于COI基因的光倒刺鲃群体遗传多样性与遗传分化研究作者：李文俊李强韩崇李陇旭易祖盛桂林钟良明来源：《安徽农业科学》2021年第22期摘要 [目的]全面了解光倒刺鲃的遗传多样性和遗传结构，为其种质资源保护和利用提供科学依据。

[方法]采用自行设计的引物对9条水系共209尾光倒刺鲃样本的线粒体COI基因序列进行测定与分析，并探讨其遗传结构和遗传多样性水平。

[结果]在209条COI基因序列中，共检测到12个单倍型，单倍型多样性为0.80 核苷酸多样性为0.008 2。

单倍型系统树显示，所有群体聚成2支，东江群体的全部样本及北江、赣江和九龙江水系的部分样本组成Ⅰ支，其余样本组成Ⅱ支。

单倍型网络分析显示，东江群体单倍型与北江、赣江和九龙江部分个体关系较近，但与其他个體关系相对较远;珠江水系大部分群体与长江、钱塘江、九龙江大部分群体分布于不同的分支。

AMOVA分析表明，光倒刺鲃COI基因序列变异主要来自地理区内群体间，占82.33%。

错配分析及中性检验显示，大多数群体相对稳定，未发生过群体扩张。

[结论]光倒刺鲃群体的遗传多样性总体偏低，应加强对其种质资源的保护;东江水系与珠江水系其他群体既存在一定隔离，又存在着基因交流;珠江水系群体与长江水系群体间分化明显。

关键词光倒刺鲃;COI基因;遗传多样性;遗传分化中图分类号 S-917.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）22-0125-04doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.22.030开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Genetic Diversity and Genetic Differentiation of Spinibarbus hollandi Based on COI geneLI Wen-jun， LI Qiang， HAN Chong et al（School of Life Science， Guangzhou University， Guangzhou，Guangdong 510006）Abstract [Objective] To understand the genetic diversity and genetic structure of Spinibarbus hollandi more comprehensively， and provide scientific basis for the conservation and utilization of its wild germplasm resources.[Method] The mitochondrial COI gene sequences of 209 S. hollandi samples from 9 rivers were determined and analyzed with designed primers， and its genetic diversity and genetic differentiation level were discussed. [Result] Among 209 COI gene sequences， 12 haplotypes were detected， with haplotype diversity of 0.801 0 and nucleotide diversity of 0.008 2. Phylogenetic tree of haplotypes showed that all haplotypes gathered into two branches （branches 1：all the samples Dongjiang population and some individuals of Beijiang， Ganjiang and Jiulong River）. Network analysis of haplotypes showed that haplotype of Dongjiang population was closely related to some individuals in Beijiang， Ganjiang and Jiulong River， but far related to other individuals. The majority of the population of the Pearl River distributed in different branches compared with the majority of the population of the Yangtze River， Qiantang River， and Jiulong River. AMOVA analysis showed that the variation of COI gene sequences of S. hollandi was mainly from within groups， accounting for 82.33%. Mismatch analysis and neutral test showed that mostpopulations were relatively stable without population expansion. [Conclusion] The genetic diversity of S. hollandi population is generally low， so the protection of its germplasm resources should be strengthened. There is not only certain isolation but also gene exchange between Dongjiang population and other populations in the Pearl River. There is obvious differentiation of populations between the Pearl River and the Yangtze River.Key words Spinibarbus hollandi;Cytochrome oxidase subunit I sequence;Geneticdiversity;Genetic differentiation鱼类线粒体DNA已成为研究鱼类进化遗传与系统演化关系的重要分子标记，广泛应用于群体遗传学研究[1]。

东海海鳗基于COI基因片段的遗传多样性分析东海海鳗（Gorgasia preclara）是一种分布于中国东海地区的深海鱼类。

为了探索东海海鳗的遗传多样性，可以利用分子生物学技术分析其基因组的COI基因片段。

COI基因片段是线粒体DNA编码的细胞色素c氧化酶亚基的一部分，被广泛用作物种鉴定和遗传多样性研究的分子标记。

首先，可以通过采集东海海鳗的组织样品，如鳍、鳞片或者肌肉组织，提取总DNA。

提取的DNA经过PCR扩增COI基因片段，得到一系列DNA片段。

这些片段可以通过电泳技术进行分离和检测。

接下来可以利用基因测序技术对PCR扩增产物进行测序，得到每个个体的COI基因序列。

收集到的COI序列可以进行序列比对，通过比对分析，可以计算出东海海鳗个体间的遗传距离。

遗传距离可以用来计算不同个体之间的相对遗传关系和遗传结构。

在进一步分析中，可以利用遗传距离来进行遗传群体结构分析。

常见的方法是使用聚类分析方法，如UPGMA（非加权对组平均法）和NJ（邻接法）。

这些方法可以将东海海鳗个体根据遗传相似性划分为不同的群体，并计算每个个体到其他个体的遗传距离。

此外，还可以利用主成分分析（PCA）和相关性分析（Correspondence analysis）等方法对个体进行遗传结构分析。

在研究东海海鳗的遗传多样性时，还可以对COI序列进行遗传多样性指数分析。

遗传多样性指数可以反映种群内和种群间的遗传多样性水平。

常见的遗传多样性指数包括平均杂合度（H）和核苷酸多样性指数（π）。

这些指标可以用来评估东海海鳗种群的遗传多样性水平，并与其他种群进行比较。

通过以上的遗传分析方法，可以揭示东海海鳗的种群结构、遗传多样性和遗传关系等重要信息。

这些信息对于保护和管理东海海鳗的资源具有重要意义，也为与东海海鳗相关的生态系统研究提供了基础数据。

基于DNA条形码技术的鱼类系统分类学研究DNA条形码技术是近年来发展起来的一种重要的遗传学技术。

它基于对基因组DNA中的一小部分区域的测序，可以提供一种快速、准确的鉴定生物种类的方法。

因此，DNA条形码技术在生物分类学研究领域发挥了非常重要的作用。

鱼类是种类非常多的一类动物，根据传统的分类学方法，鱼类的分类繁琐而复杂，不仅需要通过形态学特征进行分类判定，而且还要考虑生态习性、地理分布等因素，因此鱼类的分类一直以来都是一个难题。

然而，随着DNA条形码技术的发展，鱼类的分类学研究已经有了很大的进展。

DNA条形码技术对于鱼类分类学研究的意义在于，它可以通过测定所有鱼类物种的同一区域的DNA序列，快速、准确地获取鱼类物种之间的遗传分化信息。

这个区域被称为“COI基因”，是线粒体DNA的一部分，相对稳定，且易于进行PCR扩增和测序。

因此，通过COI基因测序，可以建立一张鱼类物种之间的遗传关系网络图，这个关系网络图可以反映不同物种之间的遗传差异，从而更为清晰地刻画各个物种之间的亲缘关系。

对于鱼类分类学研究来说，DNA条形码技术的应用可以帮助鱼类分类学家更好地了解鱼类的系统进化历史以及其形态学特征与遗传差异之间的关系。

例如，某些物种可能因为其相似的形态学特征被归为同一属或同一科，但是在遗传层面上，它们却有明显的差异，这就说明了它们的分类被漏识或被错误分类的情况。

另外，在鱼类物种繁多的情况下，DNA条形码技术可以帮助分类学家快速地鉴别各个物种的身份，这在鱼类资源保护和利用方面有着极为重要的意义。

除了对于鱼类分类学研究的影响之外，DNA条形码技术还可以帮助构建鱼类遗传多样性数据库，从而更好地了解不同物种在遗传多样性和种群遗传结构方面的差异。

这对于鱼类资源保护、遗传改良和鱼类育种都有着十分重要的作用。

尽管DNA条形码技术在鱼类分类学研究方面的应用已经取得了一些重要的进展，但是这种技术仍然面临着一些局限性。

例如，COI基因虽然稳定，但是在某些情况下，可能会出现同种内COI基因序列差异较大的情况，这些差异可能与环境因素、物种间杂交等因素有关。

4种常见鲤科鱼类DNA条形码的研究王茜;金毅成【摘要】测定了天津地区养殖的彭泽鲫、黄金鲫、乌克兰鳞鲤、鲤鱼4种共13尾鱼长度为814 bp的COI部分基因序列,以白鲢、罗非鱼作为外群.利用Mega4.1软件进行序列组成统计分析、种内及种间遗传距离分析,并用邻接法构建系统发育树(NJ树),在NJ树上共发现由不同物种组成的5个分支,这与传统的分类学结果一致.该研究结果显示,COI基因部分序列不但可以作为物种辨识的良好DNA条码,而且在鲤科鱼类的种间系统发生关系分析方面也具有一定的适用性.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)027【总页数】3页(P9281-9282,9316)【关键词】鲤科鱼类;DNA条形码;分子系统学;COI基因【作者】王茜;金毅成【作者单位】天津农学院水产科学系,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津300384;天津农学院水产科学系,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津300384【正文语种】中文【中图分类】S188利用DNA条形码技术鉴别己知物种和发现新物种构建条形码标准数据库，是目前分子生物学和分类学发展的最新方向［1－3］。

与其他分子标记如RFLP、RAPD、基因芯片技术相比，DNA条形码具有易于构建统一的DNA条形码数据库;重复性高;使用方便等优势。

2003年在美国CSHA(The Cold Spring Harbor Asia Conferences)召开的全球会议制定了国际生命条形码计划(International Barcode of Life projeet)的编定计划，并首次将DNA条形码技术用于海洋生物的普查研究［4］。

很多国际组织也自行建立DNA条形码数据库，有较大影响和较大规模的组织包括FISH－BOL、Canadian Fauna和Birds等。

FISH－BOL组织计划对所有鱼类进行DNA条形码数据库的建立，重点针对1.5万种海洋鱼类的DNA条形码，目前己经获得5 000多种鱼类的DNA条形码数据。

鳅科鱼类 DNA 条形码分析及泥鳅和大鳞副泥鳅的分子鉴定张望;陈秀开;彭勇;李正高【摘要】采集了23种鳅科鱼类89尾个体的线粒体COI基因5端序列，分析了碱基组成以及不同鳅科鱼类之间的种间遗传距离和种内遗传距离。

结果显示，鳅科鱼类的种间遗传距离显著大于种内遗传距离，表明以COI作为鳅科鱼类DNA条形码进行品种鉴定具有一定的可行性。

在建立鳅科鱼类DNA条形码的基础上，设计了主要物种泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）和大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）特异性引物，结果显示，该引物具有较高的特异性和灵敏度，能够实现对泥鳅、大鳞副泥鳅及其混合样品的物种鉴定。

%Mitochondrial COI 5 ’ sequences of 89 cobitidae fishes belonging to 23 species were collected .The DNA base composition was analyzed , the genetic variation among species and within species were calculated .It was proved that COI gene is a valid DNA barcoding gene for species identification of Cobitidae .On the basis of Cobitidae DNA barcoding, spe-cies-specific primers for Misg runus anguillicaudatus and Para misgurnus dabryanus were designed.The result suggests the species-specific primers could identify Misgurnus anguillicaudatus, Paramisgurnus dabryanus and their mixtures with high specificity and sensitivity .【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】6页(P19-24)【关键词】泥鳅(Misgurnus anguil licaudatus);DNA条形码;鳅科;物种鉴定【作者】张望;陈秀开;彭勇;李正高【作者单位】连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042【正文语种】中文【中图分类】S917.4泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)属于鲤形目(Cypriniformes)鳅超科(Cobitoidea)鳅科(Cobitidae)，是国内外消费者喜爱的经济鱼类［1］。

基于线粒体co1基因序列的dna条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用DNA条形码技术是一种新兴的物种鉴定方法，通过对生物样品中特定基因片段的序列进行分析，可以快速、精确地鉴定生物物种。

在鱼类物种中，线粒体CO1基因序列被广泛用于DNA条形码分析。

本文将探讨基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用。

一、线粒体CO1基因的特点线粒体CO1基因是线粒体DNA中编码蛋白质的基因之一。

该基因在不同鱼类物种中的序列变异性非常高，但同种鱼类物种中的序列差异很小。

这一特点使得线粒体CO1基因序列成为一种很好的DNA条形码。

此外，线粒体CO1基因的序列长度大约在650个碱基对左右，长度适中，易于测序和分析。

二、鲤科鲌属鱼类物种的特点鲌属（Carassius）是鲤科（Cyprinidae）中的一个属，包括了很多鲫鱼的近缘种。

该属鱼类物种的形态结构、生态习性和分布范围等方面存在着很大的差异。

因此，传统的形态学鉴定方法仅仅基于形态的特征来判断鱼类物种的真实身份往往存在着一定的误差。

三、基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码在鲌属鱼类物种鉴定中的应用由于鲌属鱼类物种的形态和基因序列存在一定的差异，因此可以利用线粒体CO1基因序列作为DNA条形码来鉴定不同鲌属鱼类物种之间的差异。

研究表明，基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码可以成功地鉴定不同鑫龙鱼种群之间的态差异，且比传统的形态鉴定方法更为准确和高效。

此外，基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码技术还可以用于鱼类物种的遗传连锁图谱构建、种群遗传学研究、鱼类物种起源和演化研究等领域。

研究还表明，DNA条形码技术的开发和应用对于保护和管理鱼类物种资源具有积极的意义。

四、DNA条形码技术在鱼类物种鉴定中的优点相比传统的形态学鉴定方法，DNA条形码技术具有如下优点：1.高效： DNA条形码技术可以快速准确地鉴定大量的鱼类物种，比传统的形态学鉴定方法更为高效。

CO Ⅰ基因序列在蛇鳗科鱼类种类鉴定中的适用性研究张稚兰;林汝榕;邢炳鹏【摘要】In this study,we collected DNA barcodes based on CO Ⅰ sequences from 36 individuals of 10 species in 7 genera of Ophichthyidae.The mean length of the sequences was 655bp and the average content of T,C,G and A was 27.50％,28.10％,26.00％ and18.40％,respectively.The A + T content was higher than 50％ in every species.The average Kimura two parameter (K2P) genetic distances of interspecies,intraspecies and genus were 0.52％,20.07％ and23.96％,respectively.K2P genetic distance values were found increasing with taxonomic level.Interspecific genetic distance was about 38.59 times higher than the differences of intraspecies,which met Hebert's species identification standard (interspecies genetic distance was more than 10 times of intraspecies).As high efficiency of species identification is demonstrated in the present study by DNA barcoding,we conclude that CO Ⅰ sequencing can be used to identify fish species.%为研究DNA条形码技术在蛇鳗科鱼类分类鉴定中的可行性,选取了蛇鳗科7属10种36个个体进行CO Ⅰ基因扩增,结果共获取36条基因序列,平均长度为655 bp,序列中T、C、G、A碱基的平均含量分别为:27.50％、28.10％、26.00％、18.40％,A+T含量均高于50％.样品种内、种间和属间的遗传距离(K2P)分别为:0.52％、20.07％、23.96％,遗传距离随着分类阶元的提高而增大,种间遗传距离是种内遗传距离的38.59倍,符合Hebert提出的相差10倍的物种鉴定标准,表明CO Ⅰ基因序列可以作为蛇鳗科鱼类分类鉴定的有效DNA条形码.【期刊名称】《应用海洋学学报》【年(卷),期】2017(036)003【总页数】6页(P411-416)【关键词】海洋生物学;蛇鳗科;细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因;DNA条形码;物种鉴定【作者】张稚兰;林汝榕;邢炳鹏【作者单位】国家海洋局第三海洋研究所,福建厦门361005;国家海洋局第三海洋研究所,福建厦门361005;国家海洋局第三海洋研究所,福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】P735蛇鳗科(Ophichthidae)鱼类隶属于鳗鲡目(Anguiliformes)，是鳗鲡目中种类分化最多的一个科，目前已发现55属260多种，我国已定名有13属33种，其中蛇鳗属(Ophichthus)有14种[1].主要分布于各大海洋的热带和亚热带大陆架浅水水域，多数生活于珊瑚礁和沙质沿岸，有些种类栖息于河口，少数可进入淡水生活[2].蛇鳗科鱼类身体细长，前段一般呈圆形，尾部常稍侧偏，外形及其相似，又缺少鳞片、腹鳍和尾鳍等结构，可用作鉴别的形态特征相对较少，且在不同生长阶段的形态特征不尽相同，增加了形态分类鉴定的难度.蛇鳗科鱼类不同属间的物种性状间存在重复和交叉，如蛇鳗属和蠕鳗属(Scolecenchelys)都有鳃膜骨条交叠现象等，依据形态的分类方式十分困难，易鉴别错误[3].鱼类的形态学鉴定主要是通过外部形态特征进行区分，但鱼类样品在采集过程中外部形态特征常受到损坏，并且样品形态性状受环境因子影响较大，从而导致分类困难甚至错误[4].DNA条形码技术对样品形态完整性要求低，操作简便、结果准确，已被广泛应用于鱼类的物种鉴定中，尤其是在保护生物学和生物多样性调查等领域[4-6].线粒体DNA的分子结构简单，呈母性遗传，进化速度快且几乎不发生重组，是一种应用较广的分子标记，其中线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ)是动物物种鉴定常用的目的基因[7-10].因此本研究对蛇鳗科7属10种鱼类样品的线粒体COⅠ基因片段进行了PCR扩增及序列测定，分析该基因在蛇鳗科鱼类样品鉴定中的适用性，为蛇鳗科鱼类物种鉴定及多样性研究提供分子生物学数据.1 材料与方法1.1 实验材料文中所用样品均采集于福建沿海，采样时间为2014～2015年(表1).经形态鉴定后置超低温冰箱保存，每种各选3～4条，使用天根动物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA.1.2 PCR 扩增及测序根据COⅠ基因序列设计的2对引物组合进行巢式PCR，引物C1-F和C1-R、C2-F和C2-R的序列如下：C1-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCGATCCTACATTCTCTTAGT-3’；C1-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACGCNAGTCAGCTAAANACTTT-3’；C2-F：5’-CGGCCAGTCCTCGATCCTACATTCTCTTAGTT AACAGCTAA-3’；C2-R：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTCAACCAACCACAAAGACATTGGCACCC-3’.表1 实验样品相关信息Tab.1 Information of samples in this study序号属名种名GenBank序列号1蠕蛇鳗属(Scolecenchelys)大鳍蠕蛇鳗(Scolecenchelys macroptera)KX215169、KX426302、KY472810、KY4728112虫鳗属(Muraenichthys)裸鳍虫鳗 (Muraenichthys gymnopterus)KX215178、KX215179、KX215180、KY4728163蛇鳗属(Ophichthus)短尾蛇鳗(Ophichthus brevicaudatus)KX215170 、X215171、 KY472812、KY4728134蛇鳗属尖吻蛇鳗(Ophichthus apicalis)KX215176、KX215177、KY472814、KY4728155蛇鳗属西里伯蛇鳗(Ophichthus celebicus)KX215188、KX215189、KY4728196豆齿鳗属(Pisodonophis)食蟹豆齿鳗(Pisodonophis cancrivorus)KX215181、KX215182、KY4728177豆齿鳗属(Pisoodonophis)杂食豆齿鳗(Pisoodonophis boro)KX215190、KX215191、KX355474、KX3554808新鳗属(Neenchelys)微鳍新鳗(Neenchelysparvipectoralis)KX215185、KX215186、KX215187、KY4728189须鳗属(Cirrhimuraena)中华须鳗(Cirrhimuraena chinensis)KX215192、KX215193、KX215194、KY47282010无鳍蛇鳗属(Apterichtus)克氏无鳍蛇鳗(Apterichtus klazingai)KX215197、KX215198、JQ681408*、JQ681363*、JQ681409*、JQ681407*11蛇鳗属黄蛇鳗(Ophichthus zophochir)GU440436*、EU520650*12虫鳗属裸虫鳗(Scolecenchelys gymnota)JQ432117*、JQ432116*13油鳗属(Myrophis)扁吻油鳗(Myrophisplatyrhynchus)GU224964*、GU224965*14阿尔鳗属(Ahlia)大眼阿尔鳗(Ahlia egmontis)GU224299*、GU224659*注：“*”表示序列从Genbank数据库获取PCR反应分两轮进行，使用TIANGEN公司2×Taq Plus PCR MasterMix试剂盒，体系均为25 mm3.第一轮PCR反应循环为：95℃预变性2 min，95℃变性15s，60℃退火30 s，每个循环退火温度降低0.5℃；72℃延伸50 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存.每次反应均设置阴性对照以检测是否存在污染.第2轮PCR 反应循环为：98℃预变性2 min；95℃变性15s，60°C退火30 s，每个循环退火温度降低0.3℃；68℃延伸40 s，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存.PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并进行双向测序，保证序列的可靠性.1.3 生物信息学分析运用DNAman及Chromas软件拼接每个样品正反向测序结果并进行校对后提交至GenBank(表1)并计算序列长度、碱基组成及GC含量.利用ClustalW及MEGA6.0软件检测多态位点和简约信息位点数量，使用Kimura-2-parameter(K2P)双参数模型计算种内距离及种间距离(表2).结合Genbank检索到的12条蛇鳗科序列，以邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树[11].2 结果与讨论2.1 序列结构特征分析本研究共测序获得蛇鳗科7属 10 种36 个个体的COⅠ基因片段.经比对后得到COⅠ基因5’端一段长度为655bp 的序列，共编码218 个氨基酸，所有序列没有插入、缺失密码子并不含终止密码子.36条COⅠ序列共有20个单倍型.20个COⅠ单倍型之间共检测到保守位点441 个(约占 67.33%)，变异位点215个(约占32.82%)，包括214个简约信息位点和1个自裔位点.COⅠ序列碱基组成分析显示平均碱基含量为T(27.50%)、C(28.10%)、A(26.00%)和G(18.40%)，其中C含量最高，G含量最低，A+T含量为53.5%，高于G+C 含量46.5%.密码子3个位点在碱基使用偏向性中，只有C使用频率相近，其余3个碱基使用频率有显著不同：第1密码子中4种碱基使用频率相近，分别为T(25.00%)、C(25.10%)、A(29.00%)和G(20.50%)；第2密码子中4种碱基分别为T(27.00%)、C(27.30%)、A(23.60%)和G(21.60%)；第3密码子中C含量最高，高达32.00%，A(25.30%)和T(30.00%)；G的含量最低，仅为13.20%，出现了明显的反G偏倚现象.本研究采用Kimura-2-parameter(K2P)双参数模型，使用MEGA6.0软件，结合Genebank数据库中12条COⅠ序列，计算分析样品种内、种间及属间的遗传距离.结果显示实验样品种内的K2P遗传距离为0～1.41%，平均为0.52%，其中最小距离为0，最大为大眼阿尔鳗1.41%，其次为微鳍新鳗1.02%，其余均小于1.00%.种间遗传距离为3.97%～29.33%，平均为20.07%，是种内遗传距离的38.59倍.种间遗传距离最小的两个种为大鳍蠕蛇鳗和短尾蛇鳗，其中大鳍蠕蛇鳗的种内遗传距离为0，大鳍蛇鳗的种内遗传距离为0.20%.属间的遗传距离为14.83%～37.41%，平均为23.96%.属间的遗传距离大于种内和种间的遗传距离，分类阶元越高遗传距离越大，而且遗传距离的增长随分类阶元的增加变缓.表2 各阶元K2P遗传距离Tab.2 K2P genetic divergences among different taxonomic levels阶元样品数平均值/%最小值/%最大值/%标准误差/%种内480.5201.410.38种间1420.073.9729.331.15属间823.9614.8337.411.24图1 基于COⅠ序列的蛇鳗科鱼类邻接关系树Fig.1 Neighbor-joining tree of Ophichthidae based COⅠ sequences2.2 系统进化分析利用距离法构建NJ树(图1)，14个物种共分成14组，同一物种的序列均聚合在一起，与形态学分析一致.在属及属以上阶元中，NJ系统进化树与形态学系统进化树并不一致，同属的样品未能完全聚合在一起，存在一定的交叉.2.3 讨论DNA条形码是利用一段标准的短序列进行物种鉴定，具有操作简且不受样品的形态完整性及生长发育影响，能准确鉴别形态相似种、发掘隐存种等优点，已广泛用于鱼类物种鉴定中[12-14].Ward等(2005)对澳大利亚海洋鱼类的COⅠ基因进行了研究[15]，共获取了207种鱼类的754条COⅠ基因序列，分析了它们的GC 含量以及种内、种间及属科遗传距离的差异，得出COⅠ基因序列可以用于鱼类物种鉴定.Zhang等(2011)利用COⅠ基因对日本海洋鱼类进行了鉴定研究[16]，发现158个鱼类样品的种间遗传距离是种内遗传距离的60倍，并证明了DNA条形码在鱼类不同生长阶段中鉴定的可行性.Barros-Garcia等(2016)利用DNA条形码技术对深海鱼类海蜥鱼科和棘背鱼科的样品进行了鉴定，96%的样品鉴定到种[17]. 本研究通过扩增测序共获得蛇鳗科7属10种36个个体的COⅠ基因片段.经比对后得到COⅠ基因5’端一段长度为655bp的序列，碱基组成分析显示平均碱基含量为T(27.5%)、C(28.1%)、A(26.0%)和G(18.4%).36条COⅠ序列的A+T含量相似，最高为尖吻蛇鳗(55.3%)，最低为大鳍蠕蛇鳗(52.2%)，平均含量为53.5%，均高于G+C含量，与以往鱼类COⅠ基因序列的研究结果一致[12].密码子3个位点对碱基使用偏向性有显著差异：第1密码子中4种碱基使用频率相近，分别为T(25.00%)、C(25.10%)、A(29.00%)和G(20.50%)；第2密码子中4种碱基分别为T(27.00%)、C(27.30%)、A(23.60%)和G(21.60%)；第3密码子中C含量最高，高达32.00%，A(25.30%)和T(30.00%)；G的含量最低，仅为13.20%，出现了明显的反G偏倚现象，在鳎科鱼类中也发现类似现象[18].在物种进化中，线粒体基因密码子位点会受到不同程度的碱基突变选择压，碱基使用偏向性可能是由密码子位点上碱基突变压力造成的.DNA序列能否成为物种鉴定条形码的主要标准为种内和种间遗传距离的大小.Hebert等(2003)对动物COⅠ基因研究后得出物种种内的遗传距离通常低于2%，并提出只有种间遗传距离大于种内遗传距离，且差异高于10倍时，COⅠ基因才可对物种进行有效鉴定[19].本研究所有蛇鳗科鱼类样品中，COⅠ序列种内的遗传距离为0～1.41%，平均为0.52%，其中最小距离为0，最大为大眼阿尔鳗1.41%，其次为微鳍新鳗1.02%，其余均小于1%.种间遗传距离为3.97%～29.33%，平均为20.07%，是种内遗传距离的38.59倍，符合Hebert提出的标准，表明COI基因序列可以作为蛇鳗科鱼类物种鉴定的DNA条形码.本研究利用距离法构建NJ系统进化树，在种的水平上，36样品序列首先与同种的序列聚合，14个物种共分成14组，与形态学分析一致，具有一定的低阶元系统进化分析能力，同时也验证了COⅠ序列在蛇鳗科鱼类鉴定中的可行性.同属的样品并未在NJ系统进化树聚合到一枝，不同科属间样品存在一定交叉，这与形态学系统进化树不符，可靠性明显降低.究其原因，虽然COⅠ基因序列在属及属以上水平变异增大，但是所获取基因仅为COⅠ基因5’端一段长度为655bp的序列，信息位点数量少，且在高级分类阶元中碱基置换趋于饱和，因而系统学水平上的分辨效果较差，不适合作为蛇鳗科属科阶元系统进化研究的分子标记.3 结论本研究共获得蛇鳗科7属10种36个个体的COⅠ基因片段，COⅠ序列种间的K2P遗传距离平均为20.07%，种内的K2P遗传距离平均为0.52%，种间遗传距离是种内遗传距离的38.59倍，符合Hebert等(2003)提出的相差10倍的物种鉴定标准[19]，表明COⅠ基因序列可以作为蛇鳗科鱼类物种鉴定的条形码.另外，COⅠ基因序列在属及属以上阶元分辨效果较差，不适合用于高级分类阶元分类鉴定及系统进化的研究.参考文献：[1] 唐文乔，张春光. 蛇鳗科分类综述及中国蛇鳗科系统分类(鱼纲，鳗鲡目)[J]. 上海水产大学学报， 2004，13(1): 16-22．[2] 中国科学院动物研究所，中国科学院海洋研究所，上海水产学院.南海鱼类志[M]. 北京:科学出版社，1962．[3] 刘东，唐文乔，张春光. 中国南海蛇鳗科一新纪录属及一新纪录种(鱼纲，鳗鲡目)[J]. 动物分类学报， 2005，30(1): 199-201．[4] 产久林，姜华鹏，刘一萌，等. COⅠ和16S rRNA基因在高原裂腹鱼物种鉴定中的应用[J]. 水生态学杂志， 2015，36(4): 98-104．[5] 张馨月，刘岩，张秀梅，等. 基于COⅠ基因的西南大西洋部分经济鱼类DNA 条形码鉴定[J]. 水生生物学报， 2014，38(6): 1 161-1 167．[6] 彭居俐，王绪祯，王丁，等. 基于线粒体COⅠ基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用[J]. 水生生物学报， 2009，33(2): 271-276．[7] Baek S Y， Jang K H， Choi E H， et al. DNA barcoding of metazoan zooplankton copepods from South Korea[J]. PLoS ONE， 2016，11(7):e0157307．[8] Gajapathy K， Tharmasegaram T， Eswaramohan T， et al. DNA barcoding of Sri Lankan phlebotomine sand flies using cytochrome c oxidase subunit I reveals the presence of cryptic species[J]. Acta Tropica，2016， 161: 1-7．[9] 辛翠娜，王莹，彭建军，等. DNA条形码在龟鳖类物种鉴定中的应用[J]. 林业实用技术， 2010(4): 12-14．[10] 王中铎，郭昱嵩，陈荣玲，等. 南海常见硬骨鱼类COⅠ条码序列[J]. 海洋与湖沼， 2009，40(5): 608-614．[11] Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide-sequences[J]. 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Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences， 2003， 270(1 512): 313-321．。

高原鳅属鱼类（鲤形目；条鳅科）洞穴类群的起源演化研究高原鳅属(Triplophysa)隶属于鲤形目(Cypriniformes),鳅超科(Cobitoidea),条鳅科(Nemacheilidae),是条鳅科中较大的属之一,与鲤科裂腹鱼类和鮡科鰋鮡鱼类一起构成了青藏高原鱼类区系的主体。

依据其形态特征和地理分布格局,诸多学者都认为高原鳅属鱼类的起源演化与青藏高原的隆升密切相关,因此其在青藏高原的动物地理学研究中具有重要作用。

高原鳅属鱼类在中国主要分布于青藏高原及周边地区的河流湖泊中,还有部分种类集中生活在西南地区的喀斯特洞穴中,这些物种已经呈现出不同程度的洞穴鱼类特征,如眼睛的退化和皮肤色素的消失,与青藏高原地区的种类相比具有明显的形态差异。

目前高原鳅属鱼类洞穴类群描记物种数共计27种,长江、珠江及红河水系都有其分布,其中珠江流域的西江水系是大多数洞穴类群的聚集地。

迄今,已有许多研究者对高原鳅属鱼类的系统发育关系和起源演化过程进行了探究,然而这些研究很少涉及其洞穴类群。

这一类群是中国洞穴鱼类的重要组成部分,在自然选择及适应性进化研究中具有重要的科研价值,然而目前对这一类群的研究大多还停留在新种描述的阶段,很多基础研究尚未开展,包括有关这一类群系统发育关系或起源演化等方面的研究也未见报道。

因此本研究以高原鳅属鱼类中洞穴类群为研究对象,开展以下三个方面的工作:第一,基于线粒体基因(COI,Cytb)和核基因(IRBP,RAG1和RH1)分子标记来探讨高原鳅属鱼类洞穴类群的系统发育关系及其在整个高原鳅属中的系统位置;第二,基于化石标定点和松散分子钟原理,估算高原鳅属物种间的分化时间并分析其演化规律,再基于生物地理学分析对高原鳅属洞穴类群进行祖先地理重建,最后结合这一类群现今的分布格局,探讨高原鳅属鱼类洞穴类群的起源与演化历程;第三、结合现有标本和已有的研究,综合比较高原鳅属洞穴与非洞穴类群以及洞穴类群物种之间的形态分化特点,为高原鳅属鱼类系统分类研究提供资料。

第38卷第5期大连海洋大学学报Vol.38No.5 2023年10月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Oct.2023DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-216文章编号:2095-1388(2023)05-0772-07须鳗虾虎鱼线粒体全基因组测序和系统发育分析梁阳阳1,张国庆1,陈诚1,赵秀侠1,高娜1,李静1,方婷1,杨坤1,尹峰2,郭伟2,卢文轩1∗(1.安徽省农业科学院水产研究所水产增养殖安徽省重点实验室,安徽合肥230001;2.巢湖管理局渔政管理总站,安徽合肥238001)摘要:为了解须鳗虾虎鱼(Taenioides cirratus)线粒体基因组特征和系统发育状况,采用Illumina Hiseq高通量测序技术,测定了从南渡江口㊁珠江口㊁太湖㊁巢湖和南四湖中采集的12尾须鳗虾虎鱼的线粒体全基因组,并下载近缘种线粒体全基因组序列进行系统发育分析㊂结果表明:须鳗虾虎鱼线粒体全基因组长为16641~16978bp,包含13个蛋白编码基因㊁22个tRNA基因㊁2个rRNA基因和1个D-loop控制区,各样本的编码基因序列长度较一致,线粒体全基因组长度差异主要是由控制区长度(975~1314bp)差异造成的;基于13个蛋白编码基因和2个rRNA基因序列构建系统发育树,须鳗虾虎鱼分为3个高支持率进化枝,与红狼牙虾虎鱼(Odontamblyopus rubicundus)㊁鲡形鳗虾虎鱼(Taenioides anguillaris)形成并系,太湖㊁巢湖和南四湖的须鳗虾虎鱼个体聚为1个进化枝,南渡江口和珠江口的须鳗虾虎鱼个体均分属2个进化枝㊂研究表明,青藏高原隆起和亚洲季风形成带来的中国水系格局变化,可能是须鳗虾虎鱼形成目前系统发育结构的重要原因,本研究结果可为进一步明确须鳗虾虎鱼的分类地位和资源保护提供重要依据㊂关键词:须鳗虾虎鱼;线粒体基因组;系统发育中图分类号:S917.4;Q959.483㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀须鳗虾虎鱼(Taenioides cirratus)隶属于鲈形目(Perciformes)虾虎鱼科(Gobiidae)近盲虾虎鱼亚科(Amblyopinae),是一种暖水性小型底栖鱼类,摄食小鱼㊁小虾㊁桡足类㊁其他底栖无脊椎动物和有机碎屑,喜穴居,主要栖息于河口半咸淡水水域,在中国主要分布于东海(中国近海)㊁南海(中国近海),日本㊁朝鲜㊁澳大利亚及印度洋北部也有分布[1]㊂该鱼因体表无鳞片㊁通体呈深红色,在部分地区被称为血罡鱼㊁红虫鱼等,是虾虎鱼类中经济价值相对较高的一种[2]㊂近年来,须鳗虾虎鱼入侵至巢湖㊁高邮湖㊁骆马湖和南四湖等内陆湖泊,并成为常见种[3-4],但在其原产地,如长江口㊁珠江口和南渡江口等水域,须鳗虾虎鱼资源量则不断下降㊂近盲虾虎鱼亚科鱼类体型较小,扩散能力较弱,不同地理种群间易形成遗传分化[2,5],近年来,不断有其隐存种(cryptic species)和隐藏多样性(cryptic diversity)的报道㊂据‘中国动物志“[1]记载,中国狼牙虾虎鱼属仅有拉氏狼牙虾虎鱼(Odontamblypus lacepedii)1个种[1],而Tang 等[6]基于线粒体ND5基因序列和形态学特征分析认为,中国至少存在分布于东海㊁黄海㊁渤海湾沿海的拉氏狼牙虾虎鱼,分布于北部湾㊁南海北部㊁东海南部沿海的瑞贝卡狼牙虾虎鱼(O.rebecca),以及分布于东海南部㊁黄海南部沿海的狼牙虾虎鱼未定种(Odontamblypus sp.)3个有效种㊂对于须鳗虾虎鱼,据‘中国动物志“[1]记载,中国仅有须鳗虾虎鱼1个种[1],而方嘉琪[2]基于形态学分析和线粒体COI和ND2基因序列的系统发育分析,鉴定到3个隐存种,认为海南须鳗虾虎鱼㊁珠江须鳗虾虎鱼和长江须鳗虾虎鱼可能是3个独立有效种㊂线粒体基因组(mitochondrial genome)是一段结构简单㊁长度较短的DNA分子,进化速率较快,以较短的序列片段包含了丰富的遗传信息[7],其广泛应用于鱼类系统发育㊁种群多态性和种质资源保护等研究中[8-9]㊂近年来,基因测序技术的发展㊀收稿日期:2022-07-07㊀基金项目:安徽省自然科学基金(2008085QC105);财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系资助(CARS-46);安徽省水产产业技术体系(皖农科函[2021]711号);安徽省农业科学院湿地生态与应用技术创新团队项目(2021YL055)㊀作者简介:梁阳阳(1990 ),男,博士,助理研究员㊂E-mail:liangyy10214@㊀通信作者:卢文轩(1971 ),男,研究员㊂E-mail:ahfish@为研究线粒体全基因组提供了更便捷的方法㊂本研究中,采集了海南省南渡江口㊁广东省珠江口㊁长江水系的太湖与巢湖及淮河水系的南四湖的须鳗虾虎鱼,通过二代测序技术,获得了其线粒体全基因组序列,补充了中国须鳗虾虎鱼不同地理种群线粒体全基因组数据,并结合已有的相关线粒体基因组序列系统发育分析,探究须鳗虾虎鱼不同地理种群间的遗传学差异和隐藏多样性,以期为进一步明确须鳗虾虎鱼的分类地位和资源保护提供参考依据㊂1㊀材料与方法1.1㊀采样站位的设置2017 2020年,使用定置(串联)倒须笼壶(网长为8m,网高和网宽均为30cm,网目2a =0.8cm),在海南省南渡江口(110ʎ26ᶄ8.326ᵡE,20ʎ01ᶄ39.284ᵡN)㊁广东省珠江口(113ʎ36ᶄ10.861ᵡE,22ʎ54ᶄ59.882ᵡN)㊁长江水系的太湖(120ʎ13ᶄ11.057ᵡE,31ʎ30ᶄ4.255ᵡN)与巢湖(117ʎ24ᶄ57.150ᵡE,31ʎ41ᶄ8.628ᵡN )和淮河水系的南四湖(117ʎ13ᶄ56.906ᵡE,34ʎ41ᶄ4.693ᵡN)采集须鳗虾虎鱼(图1),并获得样本165尾㊂从样本取少量肌肉本图基于自然资源部标准地图服务网站GS (2019)1694号标准地图为底图,底图边界无修改㊂The figure is based on the standard map GS (2019)1694in thestandard map service website of Ministry of Natural Resources of thePeople s Republic of China,with no modifications of the boundaries in the standard map.图1㊀须鳗虾虎鱼采样点分布Fig.1㊀Sampling sites of Taenioides cirratus组织置于2.0mL 离心管中,用无水乙醇浸泡固定,用于DNA 的提取㊂1.2㊀方法1.2.1㊀线粒体基因组测序㊀采用高盐法提取样本基因组DNA [10],用10g /L 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量,用NanoDrop ND-2000超微量分光光度计测定DNA 纯度和浓度㊂基于线粒体COI 和Cyt b基因序列(登录号:OM849673~OM849775)进行群体遗传特征分析,筛选代表性个体进行线粒体全基因组测序㊂基于COI 和Cyt b 基因序列构建的系统发育树表明,珠江口样本和南渡江口样本各聚为3个分枝,太湖㊁巢湖和南四湖样本聚为1个分枝[11]㊂从珠江口(ZJ1㊁ZJ2和ZJ3)和南渡江口(NDJ1㊁NDJ2和NDJ3)种群各选3尾,巢湖(CH1㊁CH2)㊁太湖(TH1㊁TH2)和南四湖(NSH1㊁NSH2)种群各选取2尾,共筛选12尾样本㊂采用Covaris 仪超声波将样本基因组DNA 打断成350bp 左右片段,对DNA 片段末端修复,在3ᶄ端加A 碱基和测序接头㊂对连接产物进行PCR 扩增,用磁珠回收产物并纯化,构建文库㊂DNA 文库质检合格后使用Illumina Hiseq 高通量测序平台进行双末端(paired end)测序,每个样品测序数据量不少于6Gb㊂测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成㊂过滤测序数据中的低质量读数和接头序列,使用NOVOPlasty 进行de novo 组装,参考已发表的须鳗虾虎鱼线粒体基因组序列[12](登录号:KJ944420.1),使用BioEdit 7.2.5软件对拼接的序列进行校对[13],采用MITOS 2(ht-tp://mitos.bioinf.unileipzig.de /index.py)在线软件进行基因注释㊂将获得的须鳗虾虎鱼完整线粒体基因组序列提交至NCBI (National Center for Bio-technology Information)数据库(表1)㊂1.2.2㊀系统发育分析㊀通过须鳗虾虎鱼线粒体基因序列在NCBI 数据库中进行Blast 比对,下载与须鳗虾虎鱼线粒体基因序列同源性较高的鲡形鳗虾虎鱼(Taenioides anguillaris )[14]㊁红狼牙虾虎鱼(Odontamblyopus rubicundus )[15][伍汉霖等[1]认为中国的红狼牙虾虎鱼(O .rubicundus )为误鉴,实为拉氏狼牙虾虎鱼(O .lacepedii )的异名]㊁钝孔虾虎鱼(Amblyotrypauchen arctocephalus )㊁大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris )[16-17]㊁2个鳗虾虎鱼属未定种个体,以及已发表的须鳗虾虎鱼长江水系㊁珠江㊁海南和台湾个体的线粒体基因组序列,使用河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila )[18]377第5期梁阳阳,等:须鳗虾虎鱼线粒体全基因组测序和系统发育分析作为外群(表1),进行系统发育分析㊂表1㊀线粒体系统发育分析所用基因组Tab.1㊀Complete mitochondrial genomes used in phyloge-netic analysis物种species采集地location登录号accession No.须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗巢湖OP326518须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗巢湖OP326520须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗太湖OP326525须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗太湖OP326526须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗南四湖OP326523须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗南四湖OP326524须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗珠江OP326527须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗珠江OP326528须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗珠江OP326529须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗南渡江OP326519须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗南渡江OP326521须鳗虾虎鱼(T.cirratus)∗南渡江OP326522须鳗虾虎鱼(T.cirratus)[11]台湾KJ944420.1须鳗虾虎鱼(T.cirratus)[2]珠江MK541898.1须鳗虾虎鱼(T.cirratus)[2]海南MW682859.1须鳗虾虎鱼(T.cirratus)[2]太湖MK541900.1鳗虾虎鱼属未定种(Taenioides sp.) MK541899.1鳗虾虎鱼属未定种(Taenioides sp.Ruosonghe) OL625024.1鲡形鳗虾虎鱼(T.anguillaris)[14]兴化湾KT188772.1红狼牙虾虎鱼(O.rubicundus)[15]舟山JX891626.1钝孔虾虎鱼(A.arctocephalus) NC_058264.1大弹涂鱼(B.pectinirostris)[16]慈溪NC_016195.1大弹涂鱼(B.pectinirostris)[17]北部湾MN909967.1河川沙塘鳢(O.potamophila)[18]太湖KF305680.1㊀注:∗表示样本线粒体全基因组序列为本研究获得㊂Note:∗markes the specimens in present study.采用BioEdit7.2.5截取样本线粒体基因组的13个蛋白编码基因(protein coding genes,PCGs)和2个rRNA基因序列,拼接成1条序列[19],使用DnaSP5.0统计样本的单倍型和突变位点[20]㊂使用Mr Bayes3.2.7构建贝叶斯法(Bayesian infer-ences,BI)系统发育树[21],运行4条独立的马尔可夫链(Markov chains),运行50000000代,每1000代抽样1次,丢弃前25%,当分列频率平均标准差小于0.01时认为分析趋于稳定,计算各分枝的后验(posterior)支持率;使用MEGA7.0构建最大似然法(maximum likelihood,ML)系统发育树,使用bootstrap(重复次数5000)检验各分枝的置信度[22]㊂由于缺乏关于须鳗虾虎鱼线粒体基因序列分歧速率的报道,仅Mukai等[23]报道了虾虎鱼科吻虾虎鱼属未定种(Rhinogobius sp.)线粒体ND5基因序列的分化率为3.89%/Ma,该进化速率以地质事件作为校正点㊂因此,本研究中使用3.89%/Ma作为须鳗虾虎鱼的线粒体蛋白编码基因和rRNA基因的分歧速率㊂2㊀结果与分析2.1㊀线粒体基因组与结构须鳗虾虎鱼12尾样本线粒体基因组全长为16641~16978bp,均包含13个蛋白编码基因㊁22个tRNA基因㊁2个rRNA基因和控制区(D-loop)(图2)㊂线粒体全基因组长度差异主要是由D-loop长度(975~1314bp)差异造成的,各样本的编码基因序列长度较为一致㊂各样本线粒体基因组序列的碱基组成接近,A㊁T㊁C和G平均含量分别为28.47%㊁26.65%㊁29.08%和15.80%, A+T含量(55.12%)大于C+G含量(44.88%)㊂13个蛋白编码基因中,仅COI基因以GTG为起始密码子,其他基因均以ATG为起始密码子;终止密码子有TAG㊁TAA和不完全终止密码子TA 和T㊂12尾样本中9个蛋白编码基因的终止密码子一致,4个存在差异:ND1基因,南渡江口3号样本的终止密码子为TAG,其他样本均为TAA;ND2基因,长江和淮河水系样本的终止密码子为TAG,其他样本均为TAA;ND5和ND6基因,珠江口1号样本㊁长江水系及淮河水系样本的终止密码子图2㊀须鳗虾虎鱼线粒体基因组结构Fig.2㊀Gene map of the mitochondrial genome of Tae-nioides cirratus477大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第38卷为TAG,其他样本均为TAA㊂以巢湖样本为例,其线粒体基因组结构特征如表2所示,其他样本线粒体基因组结构与巢湖类似㊂2.2㊀系统发育分析12尾样本的13个蛋白编码基因和2个rRNA 基因组合序列长为14059~14062bp,巢湖的2个样本共享1个单倍型,其他样本互为独立单倍型,共得到11个单倍型,检测到2165个突变位点㊂基于ML法和基于BI法构建的系统发育树结构完全一致(本研究中仅列出其中1个),11个单倍型聚为3枝,其中,太湖㊁巢湖和南四湖的5个单倍型㊁珠江口的1个单倍型和已发表的1个太湖须鳗虾虎鱼单倍型(MK5419001.1)聚成分枝Ⅰ,1个南渡江口单倍型与已发表的1个台湾须鳗虾虎鱼单倍型(KJ9444201.1)㊁1个福建兴化湾鲡形鳗虾虎鱼单倍型(KT188772.1)㊁1个舟山红狼牙虾虎鱼单倍型(JX891626.1)和1个鳗虾虎鱼属未定种单倍型(OL625024.1)聚为分枝Ⅱ;2个珠江口单倍型㊁2个南渡江口单倍型和已发表的1个珠江须鳗虾虎鱼单倍型(MK541898.1)㊁1个海南须鳗虾虎鱼单倍型(MW682859.1)和1个鳗虾虎鱼属未定种单倍型(MK541899.1)聚成分枝Ⅲ(图3)㊂表2㊀巢湖须鳗虾虎鱼线粒体基因组结构特征(编号CH1)Tab.2㊀Characteristics of complete mitochondrial genome of Taenioides cirratus from the Chaohu Lake(No.CH1)3㊀讨论3.1㊀须鳗虾虎鱼线粒体基因组结构特点本研究中,12个须鳗虾虎鱼样本的线粒体全基因组结构与其他硬骨鱼相似[8],在碱基组成上同样具有明显的A+T偏好㊂线粒体基因组长度为16641~16978bp,长度的变化主要是因为部分个体D-loop的3ᶄ端存在一段143bp的串联重复序列㊂D-loop是线粒体DNA中变化最复杂的区域,其进化速率是线粒体DNA其他区段的5~10倍,近缘种甚至同种不同个体间控制区均会出现较大差异,硬骨鱼类控制区重复序列通常介于几十bp到300bp之间存在,如本研究中下载分析的须鳗虾虎鱼(KJ9444201.1)[12]㊁鲡形鳗虾虎鱼(KT188772.1)[14]㊁大弹涂鱼(MN909967.1㊁NC_016195.1)[16-17]和钝孔虾虎鱼(NC_058264.1)等在D-loop均存在一段131~144bp的重复序列,重复序列的起始位置与本研究中须鳗虾虎鱼类似㊂D-loop重复序列在进化中的作用有待进一步探究㊂3.2㊀须鳗虾虎鱼的系统发育分析本研究中构建的系统发育树显示,须鳗虾虎鱼存在3个分歧较深的分枝,其中,分枝Ⅱ的组成最577第5期梁阳阳,等:须鳗虾虎鱼线粒体全基因组测序和系统发育分析㊀分枝上数值为最大似然分析bootstrap校验百分数和贝叶斯后验概率㊂㊀Values on branches indicate the bootstrap proportions from maximum likelihood analysis and the posterior probabilities from Bayesian analysis.图3㊀基于13个蛋白编码基因和2个rRNA基因序列构建的最大似然法系统发育树Fig.3㊀ML phylogenetic tree based on the13PCGs and2rRNA genes sequences复杂,由海南和台湾的须鳗虾虎鱼与红狼牙虾虎鱼㊁鲡形鳗虾虎鱼共同组成,表明须鳗虾虎鱼非单系,与红狼牙虾虎鱼㊁鲡形鳗虾虎鱼构成并系群㊂但本研究中用于系统发育分析的红狼牙虾虎鱼和鲡形鳗虾虎鱼的样本数量较少,二者与须鳗虾虎鱼更全面的系统发育关系有待进一步研究㊂方嘉琪[2]根据COI基因和ND2基因序列,构建了近盲虾虎鱼亚科ML系统发育树,发现长江水系㊁珠江口和海南的须鳗虾虎鱼各自聚成1枝,并结合形态学特征分析认为,长江水系须鳗虾虎鱼㊁海南须鳗虾虎鱼和珠江口须鳗虾虎鱼可能是3个独立物种㊂本研究表明,须鳗虾虎鱼系统发育树虽有3个分枝,但并不是每个地理种群形成一个独立分枝,如分枝Ⅰ由长江水系样本和部分珠江口样本组成,分枝Ⅲ由部分珠江口样本和部分南渡江口样本组成㊂Zhang等[11]基于线粒体序列COI和Cyt b基因序列构建的系统发育树表明,长江水系㊁珠江口和南渡江口种群也未形成独立的系统发育枝,长江水系个体与部分珠江口个体形成一个发育枝,南渡江口部分个体与珠江口部分个体形成一个发育枝,与本研究中结果较吻合㊂故笔者认为,长江水系须鳗虾虎鱼㊁海南须鳗虾虎鱼和珠江须鳗虾虎鱼为3个有效种的观点有待商榷㊂经测年分析显示,须鳗虾虎鱼3个进化枝的分歧发生在更新世早期(2.2~1.8Ma)(图3),这可能与这一时期青藏高原的快速隆起有关㊂青藏高原在2.6~1.7Ma经历了 青藏运动 的B期和C 期,经过这两个阶段的快速隆起,青藏高原平均海拔达到2000m以上,当代亚洲季风系统形成,高原边缘河流溯源侵蚀并强烈下切,中国现代水系格局基本形成[24]㊂水系格局和季风的改变驱动鱼类谱系格局的变化,在中国裂腹鱼类(Schizotho-racine)[25]㊁(Hemiculter leucisculus)[26]和糙隐鳍鲇(Pterocryptis anomala)[27]等鱼类中有广泛报道㊂笔者推测,更新世早期的青藏高原快速隆起和当代亚洲季风形成带来的中国水系的分化,导致了须鳗虾虎鱼不同地理种群的分离㊂须鳗虾虎鱼是一种小型底栖鱼类,扩散能力相对较弱,主要栖息在河口盐度较低的水域,盐度较高的海水可能是其扩散的重要地理屏障㊂须鳗虾虎鱼系统发育树分枝Ⅰ和分枝Ⅲ均包含了2个不同地理种群的个体,各个水系的须鳗虾虎鱼种群均未形成独立分枝,表明相邻水系的须鳗虾虎鱼种群间存在基因交流㊂3.3㊀须鳗虾虎鱼资源管理本研究中,须鳗虾虎鱼具有3个分歧较深的分枝,该结果与基于线粒体序列COI和Cyt b基因序列的系统发育分析结果较为吻合[11]㊂通常情况下,677大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第38卷不同系统发育分枝的地理种群被称为进化重要单位(evolutionary significant unit)和管理单位(manage-ment unit)[28-29]㊂虽然在巢湖㊁南四湖等内陆湖泊,须鳗虾虎鱼作为本地入侵种,表现出较强的入侵能力,但根据笔者于2018 2020年的调查,须鳗虾虎鱼在原产地资源量不断下降,长江口目前已较难采集到须鳗虾虎鱼,珠江口和南渡江口的须鳗虾虎鱼资源量较以前也大幅下降㊂考虑到不同系统发育分枝之间显著的遗传学差异,建议未来将南渡江口㊁珠江口和长江水系的须鳗虾虎鱼种群视为不同管理单位进行资源管理㊂4　结论1)须鳗虾虎鱼线粒体全基因组长为16641~ 16978bp,包含13个蛋白编码基因㊁22个tRNA 基因㊁2个rRNA基因和1个D-loop,全基因组长度差异主要是由D-loop长度(975~1314bp)差异造成的㊂2)须鳗虾虎鱼个体形成3个高支持率进化枝,每个进化枝均包含了至少2个水系的须鳗虾虎鱼个体,太湖㊁巢湖和南四湖的须鳗虾虎鱼个体聚为1个进化枝,南渡江口和珠江口须鳗虾虎鱼个体均分属2个进化枝㊂建议未来将南渡江口㊁珠江口和长江水系的须鳗虾虎鱼种群视为不同管理单位进行资源管理㊂参考文献:[1]㊀伍汉霖,钟俊生.中国动物志:硬骨鱼纲鲈形目Ⅴ虾虎鱼亚目[M].北京:科学出版社,2008.㊀㊀㊀WU H L,ZHONG J S.Fauna sinica:Osteichthyes,PerciformesⅤ, Gobioidei[M].Beijing:Science Press,2008.(in 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Results showed that the length of individual mitochondrial genome was ranged from16641to16978bp,containing 13protein coding genes(PCGs),22tRNA genes,2rRNA genes and the D-loop.The length of each coding gene sequence for every sample was relatively consistent,and the difference in length of the mitochondrial genome was mainly caused by the difference in D-loop length(975-1314bp).Based on the13PCG and2rRNA gene se-quences,phylogenetic analysis combined the sequences in present study with published closely related mitogenomes showed that the goby was divided into3major clades.Samples from Taihu Lake,Chaohu Lake and Nansi Lake were clustered into one clade while samples from the Nandu River Estuary or the Pearl River Estuary were divided into two clades.Cladistic analysis depicted that T.cirratus was showed to form a paraphyletic group with Odontam-blyopus rubicundus and Taenioides anguillaris.The uplift of the Qinghai-Tibet Plateau and the formation of the Asi-an monsoon that brought about changes in water system pattern in China were the likely causes for the formation of T.cirratus current phylogenetic status.The finding provides crucially important basis for the resource conservation and further taxonomic clarification of T.cirratus.Key words:Taenioides cirratus;mitochondrial genome;phylogenetic analysis877大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第38卷。

文昌鱼和斑马鱼C1q、C3及G10的进化分析及基因表达的研究的开题报告1. 研究背景和意义作为免疫系统中最重要的组成部分之一，补体系统广泛存在于各种生物中，包括鱼类。

C1q是补体系统中的第一个成分，其作用是介导免疫细胞对病原体的清除。

C3是补体系统中最重要的成分之一，它的激活是补体系统中所有路径的共同点，能够介导上述病原体的识别和清除。

G10是一种重要的C3结合蛋白，可以增强C3分子作用的完整性和稳定性。

近年来，随着分子生物学和基因组学等技术的发展，研究人员越来越关注补体系统在鱼类中的作用。

目前已知，C1q、C3和G10基因在多种鱼类中都有表达，包括文昌鱼和斑马鱼。

然而，这些基因的进化关系以及在不同组织中的表达情况还未被深入研究。

因此，本研究旨在通过对文昌鱼和斑马鱼的C1q、C3和G10基因进行进化和表达分析，揭示其在鱼类免疫系统中的作用和机制，为今后在鱼类免疫系统领域的研究提供有价值的参考。

2. 研究内容和方法本研究将从以下两个角度进行探究：（1） C1q、C3和G10基因的进化关系通过使用生物信息学方法，从NCBI数据库中获取文昌鱼和斑马鱼的C1q、C3和G10基因序列，构建相应的进化树，并对基因序列进行进化分析。

（2） C1q、C3和G10基因在不同组织中的表达情况采集不同组织的文昌鱼和斑马鱼样本，在RNA提取和cDNA合成实验后，使用qPCR技术对C1q、C3和G10基因在不同组织中的表达情况进行分析，并根据分析结果探究不同组织中这些基因的分布情况和作用机制。

3. 研究预期结果和意义预计本研究将获得文昌鱼和斑马鱼C1q、C3和G10基因的进化关系及其在不同组织中的表达情况。

结果可以揭示这些基因在鱼类免疫系统中的作用机制，为今后的鱼类免疫系统研究提供有价值的基础研究工作。

此外，基于本研究结果的相关应用也为鱼类养殖领域的疾病预防和治疗提供了有力的理论支持。

基于DNA条形码对南极Yelcho站周边海域鱼类的种类鉴定李渊;张然;宋普庆;李海;陈坚;林龙山【摘要】As an important part of the Antarctic Ocean ecosystem, Antarctic fish play a role in material cycling and the energy flow within the food web. Individual Antarctic fish specimens were collected from the sea adjacent to Yelcho Station during the 32nd Chinese National Antarctic Research Expedition, and morpho-logical analysis and DNA barcoding were employed in their identification. After running blast searches in NCBI, sequence similarity results showed that only two individuals were identifiable to the species level, while six individuals were unmatched. Combined with a homologous sequence from GenBank, phylogenetic analysis was performed and four groups were unambiguously identified from the NJ tree. There was clear overlap (barcoding gap) between intraspecific and interspecific variabilities in each species, as the smallest interspecific divergences were well below 2％, while the largest intraspecific divergences were above 2％. Three valid species were detected from eight individuals, encompassing seven Nototheniidae fish and one Harpagiferidae fish. Finally, all results further confirmed that notothenioid fish were dominant in terms of species diversity and biomass in the investigated seas.%南极鱼类是南极海洋生态系统的重要组成部分,在食物网的物质循环和能量流动中起着重要的作用.利用中国第32次南极考察暨中智第2次联合南极半岛综合科学考察采集Yelcho站周边海域南极鱼类,并基于形态学和DNA条形码技术对其进行种类鉴定.序列相似性结果显示仅2尾鱼类能准确鉴定到种,剩余6尾属于模糊种;结合GenBank中的同源序列对其进行系统发育分析,结果显示所有样品能明显分为4个组群,且各物种的最小种间遗传距离均高于该物种的最大种内遗传距离,存在明显的条形码间隙,证明各物种鉴定结果的有效性.8尾样品内存在3个有效种,南极鱼科7尾,裸南极鱼科1尾,在一定程度上反映出Yelcho站周边海域鱼类在物种组成和生物量上均以南极鱼科鱼类为主.【期刊名称】《极地研究》【年(卷),期】2018(030)002【总页数】7页(P192-198)【关键词】南极鱼科;DNA条形码;序列相似性;条形码间隙;遗传距离【作者】李渊;张然;宋普庆;李海;陈坚;林龙山【作者单位】国家海洋局第三海洋研究所,福建厦门 361005;国家海洋局第三海洋研究所,福建厦门 361005;国家海洋局第三海洋研究所,福建厦门 361005;国家海洋局第三海洋研究所,福建厦门 361005;国家海洋局第三海洋研究所,福建厦门361005;国家海洋局第三海洋研究所,福建厦门 361005【正文语种】中文0 引言南大洋具有独特的海洋生态环境, 常年低温、海冰漂浮、初级生产力波动剧烈等是其主要的特征, 而南极鱼类则是该海域具有代表性的种类之一, 在食物网中具有重要的位置, 在经历了显著的辐射进化后已适应了南极大尺度极端的生态系统[1]。