荧光胺柱前衍生高效液相色谱法测定牛肉中的盐酸克伦特罗

庞坤，张敬轩，俞婧，李挥*(河北省食品质量监督检验研究院，石家庄050051)摘要：建立了高效液相色谱-荧光检测器测定牛肉中的盐酸克伦特罗的方法。

样品通过提取、净化、荧光胺柱前衍生化，用配有荧光检测器的高效液相色谱仪测定，外标法定量。

方法检出限为0.5μg/g ，在2.0～100ng/mL 范围内，线性相关系数R 为0.9996。

在2.0、10、20μg/g 3种浓度添加水平，盐酸克伦特罗的回收率为85.15%～93.25%，相对标准偏差为2.81%～3.16%。

该方法重现性好、灵敏度高、特异性强，可用于牛肉中盐酸克伦特罗残留的检测。

关键词：荧光胺；衍生；高效液相色谱；盐酸克伦特罗中图分类号：O 657.7文献标志码：A文章编号：1005-9989(2011)03-0282-04荧光胺柱前衍生高效液相色谱法测定牛肉中的盐酸克伦特罗Fluorescamine derivatization determination of clenbuterolhydrochloride residues in beef by HPLC with fluorescence detectorPANG Kun,ZHANG Jing-xuan,YU Jing,LI Hui*(Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research,Shijiazhuang 050051)Abstract:A method was developed for the determination of clenbuterol hydrochloride residues in beef byHPLC with fluorescence detector.The sample was extracted,purified and pre -column derivatization with fluorescamine,then analyzed by HPLC-fluorescence detector.The quantitative method was external standard method.The detection limit of the method was 0.5μg/g.The linear range was 2.0～100μg/mL with correlation coefficient above 0.9996.Experiments on spiked samples of beef,showed that at addition level of 2.0μg/g,10μg/g,20μg/g,the mean recoveries were in the range of 85.15%and 93.25%,and accordingly the relative standard deviation ranged from 2.81%to 3.16%.This method is repeatable,sensitive and accurate.Key words:fluorescamine;derivatization;HPLC;clenbuterol hydrochloride收稿日期：2010-12-13*通讯作者基金项目：河北省科技支撑项目(09227134D)。

作者简介：庞坤(1984—)，男，硕士，助理工程师，研究方向为食品安全分析。

盐酸克伦特罗，是一种人工合成的β-肾上腺素受体激动剂，可使体内脂肪分解加强，血中游离脂肪酸增加，摄入的能量不再形成脂肪贮存于体内，而是立即为蛋白质的合成所利用，并抑制蛋白质分解和促使胰岛素释放和糖原分解加强，具有营养重分配的作用。

盐酸克伦特罗能使饲料转化率和瘦肉率提高10%～15%，因此又称为“瘦肉精”，往往被非法用于肉用动物的生产之中。

我国己将其列为禁用的饲料药物添加剂，并规定不得检出。

但受经济利益的驱使，在畜禽养殖业非法使用的情况依然不容乐观，近年来国内发生多起因食用含克伦特罗残留的食品发生中毒的事件。

·282·因此，研究快速定量检测克伦特罗残留量具有十分广泛的意义。

目前对盐酸克伦特罗检测方法的研究主要有酶免疫分析法[1-2]、高效液相色谱法-紫外检测法[3-5]、气相色谱-质谱联用法[6-7]、及高效液相色谱-质谱法[8-10]。

但酶免疫测定法存在假阳性率高的缺点；高效液相色谱紫外检测法灵敏度不高；气相色谱-质谱法、高效液相色谱-质谱法所需设备昂贵操作复杂。

本研究在已有测定方法的基础上，建立了高效、灵敏、简便的荧光胺柱前衍生高效液相色谱荧光检测法测定牛肉中克伦特罗残留的方法。

1材料与方法1.1材料与试剂盐酸克伦特罗标准品：Si g ma公司，纯度99.9%；甲醇、乙醇：色谱纯；其余所用试剂：分析纯；实验用水为密理博纯水机制得。

1.2仪器与设备A g lie n t1200高效液相色谱系统：配有荧光检测器和R e v.B.03.02色谱工作站，美国安捷伦公司；A S超声波清洗器：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；RT15T高速冷冻离心机：上海天美公司；A E200分析天平：法国M ettler公司；氮吹仪，O r g a n omatio n A ssociates,J n c.；涡流振荡器：德国I K A公司；MC X固相萃取柱：60m g/3mL，美国沃特世公司。

1.3实验条件1.3.1色谱条件色谱柱：A g ile n t Eclipse X D B-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈和0.02mol/L磷酸二氢钠溶液(v∶v=30∶70)；流速：1.0 mL/mi n；检测波长：λex=405n m，λem=495n m；进样量：20μL；柱温：30℃。

1.3.2标准溶液的制备配制浓度为1μg/mL的盐酸克伦特罗标准溶液作为储备液。

盐酸克伦特罗标准使用溶液：准确量取盐酸克伦特罗储备液0、20、100、200、500、1000μL，分别置于10mL 容量瓶中，用0.1mol/L N a H2P O4(p H=6.0)溶液定容，得到0.0、2.0、10.0、20.0、50.0、100ng/mL的标准使用溶液。

1.3.3样品的预处理准确称取4g粉碎好的牛肉样品于50mL离心管内，加入0.1mol/L HC l O4溶液15mL，涡旋混匀，用高氯酸调p H至1.0，在超声波水浴中超声30mi n后，取出置于80℃水浴加热30mi n。

取出冷却后10000r/mi n离心10mi n，移取上清液，用10mol/L N a OH溶液调p H至9.5±0.3，再以5000r/mi n的速率离心5mi n，将上清液转移至另一离心管内。

用0.1mol/L HC l O4调p H值2.0；6000r/mi n离心；取上清液，待净化。

MC X小柱依次用5mL甲醇、5mL水和5mL 30mmol/L盐酸活化，然后将样品液上样至固相萃取小柱中，依次用5mL水和5mL甲醇淋洗柱子。

在溶剂流过固相萃取柱后，抽干MC X小柱5mi n，再用5mL5%氨化甲醇溶液洗脱，洗脱液在40℃水浴中用氮气流下吹干，用0.5mL甲醇定容。

1.3.4样品的衍生化准确移取0.5mL该样品溶液或标准工作溶液，放入2mL样品瓶中，加入0.4 mL硼酸钠(p H9.0)缓冲溶液，拧好瓶盖摇匀。

再加入0.1mL0.02%荧光胺丙酮溶液，拧好瓶盖摇匀，放入25℃水浴中衍生化反应20mi n。

衍生化后的样品溶液用液相色谱-荧光检测器测定。

2结果与分析2.1样品的提取和净化克伦特罗在酸性条件下带正电荷，易溶于水、酸溶液和水溶性有机溶剂，难溶于正己烷等非极性有机溶剂，而在碱性溶液中可以游离形式存在，溶于大多数有机溶剂。

对于动物组织中盐酸克伦特罗残留，多数方法用稀酸溶液提取[11-12]，也有采用有机试剂提取[13]。

本研究采用5%高氯酸溶液作为提取剂酸化样品，使样品中的盐酸克伦特罗呈离子状态，可被有效的提取。

同时在样品中加入高氯酸溶液，并调p H至蛋白质的等电点以下(p H1.0)可使蛋白质变性，起到净化作用。

超声30 mi n后80℃水浴30mi n，在有效地提取目标化合物的同时又能进一步沉淀了大部份蛋白质。

调节p H至9.5后离心可沉淀掉碱不溶性杂质。

实验结果显示本方法能达到较好的提取效果，同时能较大程度地除去蛋白等杂质，简化了操作步骤。

对克伦特罗提取液的净化技术主要是固相萃取技术，已报道采用的固相萃取柱有C18柱、H LB 柱、S C X柱、WC X柱、SL H柱等[14-18]。

本方法选用常用的MC X固相萃取小柱为净化柱。

MC X固相萃取小柱具有非极性饱和阳离子交换双重功能，在酸性条件下对盐酸克伦特罗有非常强的吸附性能，淋洗杂质后，再用碱性有机溶剂进进行洗脱，且洗脱液杂质少，易吹干，回收率好。

采用MC X 小柱为净化柱有很好的净化效果。

2.2衍生条件的选择·283·2.2.1p H 对衍生反应的影响保持衍生化的温度和时间、衍生剂的用量不变，将同一浓度混合标准溶液加入不同的缓冲溶液(p H 5.0乙酸钠缓冲液；p H 7.0、p H8.0、p H 12.0磷酸盐缓冲液；p H 9.0硼酸钠缓冲液；p H 10.0碳酸盐缓冲液)与衍生剂在不同的p H 条件下测定。

从图1中可以看出，加入p H 9.0硼酸钠缓冲液时，衍生产物的荧光强度最大，因此选择p H9.0硼酸钠缓冲液。

2.2.2衍生试剂加入量对衍生反应的影响保持其他衍生条件不变的情况下，改变荧光胺丙酮溶液的加入量分别为0.02、0.05、0.10、0.20、0.30mL 。

然后加入硼酸盐缓冲液(p H9.0)定容至1.0mL ，反应20mi n 后测定其荧光值。

实验结果表明，在低加入量时随着加入量的增加荧光强度也随之增加，当加入量为0.10mL 时荧光强度达到最大值，然后随着衍生试剂加入量的增加，荧光值达到稳定，所以衍生试剂加入量为0.10mL 。

2.2.3衍生时间对衍生反应的影响衍生反应可在室温下进行。

故在上述优化条件下，考察时间对衍生反应的影响，分别改变反应时间。

结果表明，反应时间在20mi n 之后，衍生产物荧光值达到稳定，在1h 后开始缓慢下降。

最终反应时间确定为20mi n ，并在1h 内进行测定，否则衍生产物会发生分解从而影响最终定量结果。

2.3方法的线性范围和检测限用1.3.2制得的标准系列溶液，按照1.3.4的方法衍生后进样，以盐酸克伦特罗进样浓度(X )为横坐标，色谱峰面积积分值(Y )为纵坐标绘制标准曲线。