MTT比色法-细胞增殖及细胞活性测定-实验

MTT实验一．实验原理检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。

三．实验步骤1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清，正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。

2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。

（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。

）3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结晶的生成。

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等，它的特点是灵敏度高、经济。

学术术语来源---Bio-gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化文章亮点：1 实验先采用全骨髓血培养法培养犬骨髓间充质干细胞，继而采用贴壁筛选纯化，方法简便，所获细胞数量及纯度满意，并在体外成功诱导分化出软骨细胞。

2 实验所采用的细胞支架材料为瑞士Geistlich公司生产Bio-gide胶原膜，这是一种由Ⅰ型和Ⅲ型胶原组成复合材料，分为致密层和疏松层，种子细胞接种在胶原膜的较为粗糙的疏松层，而光滑的致密层在体内实验中朝向关节腔，有利于骨髓间充质干细胞的黏附、生长及向软骨细胞的分化，三维立体培养有助于诱导生成的软骨细胞维持表型。

3 实验显示Bio-gide胶原膜与骨髓间充质干细胞复合培养有良好的生物相容性，但能否体内构建组织工程软骨组织，促进软骨细胞的生长，缺损的软骨组织得到完整的修复，尚待进一步研究。

关键词：生物材料；组织工程软骨材料；膜生物材料；骨髓间充质干细胞；Bio-gide胶原膜；组织工程；股骨头坏死；软骨缺损；种子细胞；国家科学自然基金摘要背景：应用组织工程方法修复股骨头坏死后的软骨损伤应解决的2个关键因素是种子细胞和支架材料。

目的：探讨Bio-gide胶原膜体外与犬骨髓间充质干细胞复合成软骨的可行性。

方法：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法体外分离培养比格犬骨髓间充质干细胞，观察细胞形态学变化，以细胞表面抗原进行鉴定。

3H胸腺嘧啶核 苷掺入检查法
3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法
原理：当淋巴细胞受分裂原(PHA等)或特异性抗原刺激发生转化时， 必然伴有DNA的大量合成，若将具有放射性的3H-TdR加到培养液内， 则可被作为合成DNA的原料而摄入转化中的细胞内，测定细胞内放 射性物质的相对数量(以脉冲数cpm表示)，就能客观地反映淋巴细 胞对刺激物的应答水平。
MTT法
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活 性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞 毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它 的特点是灵敏度高、经济。
淋巴细胞的功能测定技术
T细胞+PHA
培养，淋巴母细胞转化
染色 +3H-TdR
计数转化细胞百分率 测定cpm值
测定OD值
谢谢！
医学免疫实验
作业
市场上有一广告产品，据说有免疫 增强作用，请设计一个方案证实之 （从影响淋巴细胞功能、T淋巴细 胞增殖的角度考虑）。
T细胞增殖实验 3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法（核素法） MTT法
T细胞增殖实验
原理：又称T细胞转化试验。T细胞在体外经某种物质刺 激，细胞代谢和形态相继变化，在24~48h细胞内蛋白质 和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变 化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松 等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细 胞增殖又叫淋巴细胞转化。据此可判断出淋巴细胞对有 关刺激的反应性与功能状态。 (1) 非抗原性刺激物:如植物血凝素(PHA)、刀豆素 A(ConA)、美洲商陆(PWM)、脂多糖(LPS)，通称促有丝分 裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B细胞，PHA和 ConA刺激T细胞增殖。 (2) 抗原性刺激物:如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤风 类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗原等。

细胞增殖检测技术--MTT法一、基本原理MTT法检测细胞增殖原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

Formazan经二甲基亚砜（DMSO）溶解后用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

根据测得的吸光度值（OD 值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

二、操作步骤（1）接种96孔板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200 μL，37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入20μl储液浓度为4 mg／ml，，终浓度为100μg/ml 培养4h。

（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（200μL／孔），将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶物溶解。

（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570 nm）。

三、注意事项：1. MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5 mg/ml于-20℃长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

2. MTT有致癌性，用时注意安全。

3. 在进行MTT比色法细胞活力检测实验前，需要掌握细胞的贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定实验中每孔的接种细胞数和培养时间。

这样，才能保证形成酌量的MTT结晶，与细胞数量呈线性关系。

4. 设空白对照。

与实验孔平行设不加细胞只加培养液的空白孔。

其它实验步骤保持一致，以空白孔调零。

MTT: AMRESCO 公司货号 0793-5G配置方法现用现配溶解于双无培养基中，酶标仪 Thermo 公司 Multiskan FC 型酶标仪5. 避免血清干扰。