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荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。
实验室应该保持干燥、清洁和无菌。
检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。
2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。
在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。
同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。
3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。
可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。
同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。
4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。
反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。
5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。
引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。
引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。
6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。
注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。
7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。
可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。
计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。
总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。
在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR仪操作流程1、开启电脑，并打开Smart Cycler开关,启动Smart软件，系统用户名为Smart，密码为Cycler。
若Create Run 图标非灰色，表明机器已与电脑连接，否则应重新连接，直至Create Run 图标变亮。
2、定义一个程序⑴. 点击Define Protocols 图标。
⑵. 点击New Protocols 图标。
⑶. 输入一个独特的程序名。
⑷. 输入热循环参数。
⑸.点击Save Protocol按钮。
3、创建运行⑴. 点击Create Run 图标。
⑵. 输入一个Run Name。
⑶. 选择Dye Set。
⑷. 点击Add/Remove Site按钮⑷a. 突出一个程序名。
⑷b. 突出位点。
⑷c.点击右箭头。
⑷d.重复⑷a-⑷c步骤直到所有程序和点都被选定。
⑸.点击OK。
⑹.点击Start Run按钮。
4、实时监控反应过程（这一步可省）5、实验完毕，分析实验结果运行开始后，程序会自动切换到View Results栏。
在运行过程中，用户能实时监控温度和光学数据，选择图表，分析设置和样品类型信息。
在运行完成前后及运行期间，分析设置、图表和样品类型信息可以改变。
运行过程中，可以查看存在电脑中的以前的运行。
6、保存并输出实验数据⑴点击View Results显示栏的Export按钮。
⑵检查输出数据类型。
⑶点击Export Data根目录里的Export按钮。
⑷从Look In下拉菜单里选择一个文件夹。
程序默认为Smart Cycler文件夹里的Export文件夹。
⑸.输入一个文件名或接受一个默认的文件名，点击Save。
生物技术中心仪器管理人：李红兵2006年10月15日。
HPV-DNA标本处理的标准操作程序1一、目的：规范临床分子生物实验室对临床标本的处理，提高检测结果的准确率。
二、适用范围：人乳头状瘤病毒（HPV）基因微阵列分型检测试剂盒。
三、职责：由临床分子生物实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：2.1对于宫颈脱落细胞标本，先振荡混匀临床样本10秒，取800l临床样本加入样本管，14000rpm离心5分钟，去上清液（若收集到的有效细胞太少的话，可再次吸取取800l临床样本加入样本管，14000rpm离心5分钟，去上清液）；2.2对于男性标本（棉拭子），先加入1ml生理盐水，充分振荡洗脱细胞，倒出洗脱液，14000rpm离心5分钟，去上清液；2.3对于血液太多的临床标本，可将收集到的细胞用已灭菌的蒸馏水漂洗一次，再离心收集细胞。
3、加入400l溶液Ⅰ(如果出现沉淀应在45℃水浴中预热)，将收集到的细胞振荡混匀，在100℃煮沸15分钟。
4、从沸水中取出样本管，点动离心，开盖，加入400l溶液Ⅱ，混匀后，室温下放置2分钟后，14000rpm离心5分钟，将上清液倒入废液缸，14000rpm离心1分钟，用200μl移液器，轻轻将剩余的上清液吸尽，枪头切勿碰到离心沉淀方向的管壁，以免将DNA吸掉。
5、开盖静置至少2分钟，加入60l溶液Ⅲ充分溶解，静置10分钟。
14000rpm离心1分钟取1l样品做PCR检测,或者贮存-20℃冰箱中备用。
lu08.1液转入HPV样本处理流程图此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。
振荡取制定者吸审核者批准者年月日年月日年月日。
荧光定量PCR操作流程1.目的基因引物的合成设计合成200-300bp目的基因片段的引物，利用primer 5.0引物设计工具或者手工合成，引物合成过程中注意上下游的Tm值要相似、GC碱基在上下游的引物里均匀、引物与模板序列紧密互补、引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构等事项。
2 总RNA提取（1）准备研钵（灭菌）、离心管（1.5ML），枪头、手套（一次性）、异丙醇、乙醇，三氯甲烷2）取适量家蚕组织，加液氮充分研磨；匀浆加1ml RNAiso Plus后匀浆；3）室温放置5min （可在-70℃下保存1个月）4）加0.2ml氯仿（chloroform），振荡混匀，室温放置5分钟；5）12000g，15min，4℃；6）取上清（约0.6ml），加与上清等体积异丙醇，室温放置10分钟；7）12000g，10min，4℃；8）取沉淀（RNA呈胶状沉淀），加1ml 75%乙醇（可在-20℃保存1年）洗涤；9）12000g，5min，4℃；10）取沉淀，室温干燥10min；11）溶解于DEPC处理水中12）-80℃保存，尽快使用，或在8）保存。
3 反转录（TOYOBO试剂盒）Nuclease-free water up to 10ul5ⅹRT buffer 2ulRT Enzyme Mix 0.5ulPrimer Mix 0.5ulRNA 0.5-1ug4定量PCR反应（本实验室7300系统）SYBR 10ulForward Primer 1ulReverse Primer 1ulROXⅠ 0.4ulc DNA模板2ul一个模板重复三次以尽量减小误差；每个模板都要设内参。
内参是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。
而后按照试剂盒说明操作流程设定仪器参数即可。
荧光定量pcr检测步骤嘿，朋友们！今天咱就来唠唠荧光定量PCR 检测步骤这档子事儿。
你想想看啊，这就好比一场奇妙的旅程。
首先呢，咱得把要检测的样本准备好，这就像是给旅程准备行囊，可不能马虎呀！样本得纯净，不能有杂七杂八的东西捣乱。
然后呢，就是设计引物啦！这引物就像是旅程中的指南针，得特别精准，才能指引我们往正确的方向走。
设计得不好，那可就容易迷路啦，检测结果也会乱七八糟的。
接下来，就是配制反应体系啦！各种试剂就像旅途中的伙伴，得搭配好，让它们和谐共处，共同发挥作用。
这可不是随便倒倒就行的，得精确再精确。
再之后，把样本和反应体系混合好，放进PCR 仪里。
这PCR 仪啊，就像是旅程中的交通工具，带着我们的样本和反应体系一路前行。
在这个过程中，温度会不断变化，就像车子在不同的路况下行驶一样。
在 PCR 仪里跑了一段时间后，就到了检测荧光信号的时候啦！这荧光信号就像是旅途中的美景，我们得仔细观察，不能错过任何一个精彩瞬间。
嘿，你说这荧光定量 PCR 检测是不是很有意思？就像一次充满挑战和惊喜的冒险！每一步都得小心翼翼，却又充满期待。
要是哪一步出了差错，那可就前功尽弃啦！所以啊，做这个检测的时候，可得打起十二分的精神来。
就像你去旅行，总不能稀里糊涂的吧！得认真准备，认真对待每一个环节。
你想想，如果因为自己的不小心，导致检测结果不准确，那得多郁闷呀！这可关系到很多重要的事情呢，比如疾病的诊断、科学研究的进展。
哎呀，说了这么多，相信你对荧光定量 PCR 检测步骤也有了一定的了解啦！总之，认真对待，就像对待生活中的每一件重要事情一样，准没错！希望大家都能在这个奇妙的检测世界里顺利前行，得到准确又可靠的结果哟！。
