工业微生物物理诱变育种技术的新进展

生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ２００７年第２期・技术与方法・收稿日期：２００６－１０－２３基金项目：国家９７３课题（２００４ＣＢ７１９６０４）资助作者简介：汪杏莉（１９８２－），女，河南宜阳人，在读硕士研究生，主要从事离子束生物技术研究通讯作者：陈林海１９２７年，Ｍｕｌｌｅｒ发现Ｘ射线能诱发果蝇基因突变，从此开创了诱变育种技术的先河。

经过近一个世纪的不断发展和完善，诱变育种尤其是物理诱变育种技术已成为目前工业微生物育种中最为常用和最有效的技术之一。

物理诱变是使用辐射中的各种射线为诱变源（包括紫外线、Ｘ射线、γ射线、快中子、微波、超声波、电磁波、激光和宇宙射线等），对生物靶进行诱变。

多年的育种实践发现，对微生物诱变效果较好且应用较广泛的主要有紫外线、Ｘ射线、γ射线和快中子［１］。

这些诱变技术设备简单、操作方便，利用这些诱变源进行单一或复合诱变，已得到了大量的高产工业微生物菌株。

如在４０余年中，经过多次诱变，青霉素生产菌的产量增加了３００多倍，效价达到６０００￣８９００Ｕ／ｍｌ［２］；胡学智［３］等以地衣芽孢杆菌Ｂ．１９８为出发株，先后以ＵＶ、６０Ｃｏγ射线等复合处理，得到菌株Ａ．４０４１，"－淀粉酶的酶活提高１００倍；周建琴［４］等用Ｎｏｃａｒｄｉａｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉｖａｒ．ＫａｎｇｌｅｎｓｉｓＳＴ－９１采用紫外诱变方法，筛选到一株Ｕ１０－Ｓ－４，在５ｔ罐上康乐霉素效价比ＳＴ－９１提高４６０多倍。

可见，这些传统的诱变育种技术在２０工业微生物物理诱变育种技术的新进展汪杏莉李宗伟陈林海刘晓波谢慧波（郑州大学离子束生物工程省重点实验室，郑州４５００５２）摘要：物理诱变技术是当今工业微生物育种中最重要、最有效的技术之一。

传统的物理诱变技术主要有紫外线、Ｘ射线、γ射线诱变等，它们已在包括青霉素、"－淀粉酶等几乎所有的工业微生物菌种的诱变选育中发挥了巨大的作用。

多数菌株在多次重复使用传统诱变源时往往出现抗性饱和的现象。

太空环境、离子束、激光等是２０世纪７０￣８０年代逐渐兴起的新型诱变技术，因它们具有诱变谱广和在一定程度上能克服菌株对传统诱变源的抗性饱和等优点，而广受工业微生物育种工作者的欢迎。

现就空间、离子束、激光等诱变育种技术的作用特点、诱变机理、应用及前景进行阐述。

关键词：诱变育种空间诱变离子注入激光诱变ＴｈｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｃａｌＭｕｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｅＢｒｅｅｄｉｎｇＷａｎｇＸｉｎｇｌｉＬｉＺｏｎｇｗｅｉＣｈｅｎＬｉｎｈａｉＬｉｕＸｉａｏｂｏＸｉｅＨｕｉｂｏ（ＨｅｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｆＩｏｎＢｅａｍＢｉｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５００５２）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｈｙｓｉｃａｌｍｕｔａｔｉｏｎｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｐｈｙｓｉｃａｌｍｕｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｍａｉｎｌｙｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｒａｄｉａｔｉｏｎｍｕｔａｔｉｏｎ，Ｘｒａｄｉａｔｉｏｎｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄγｒａｄｉａｔｉｏｎｍｕｔａｔｉｏｎ，ｈａｖｅｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｎｅａｒｌｙａｌｌｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ，ｓｕｃｈａｓｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎｓａｎｄ"－ａｍｙｌａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎｓ．Ｍａｎｙｍｉｃｒｏｂｅｓｈａｖｅｓｈｏｗｅｄａｋｉｎｄｏｆｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｓａｔｕｒａｔｉｏｎｗｈｅｎｒｅｐｅａｔｅｄｌｙｍｕｔａｔｅｄｂｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｕｔａｇｅｎｓ．Ｏｗｎｉｎｇｔｏｔｈｅｉｒｗｉｄｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｄｈａｖｉｎｇｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｐａｒｔｉａｌｌｙｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｓａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｕｔａｔｉｏｎ，ｎｅｗｍｕｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ａｒｉｓｉｎｇｆｒｏｍ１９７０ｓｔｏ１９８０ｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｏｆｓｐａｃｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｉｏｎｂｅａｍａｎｄｌａｓｅｒ，ａｎｄｅｔｃ．，ｈａｖｅｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙａｐｐｌｉｅｄｂｙｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｏｆｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆｓｐａｃｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｉｏｎｂｅａｍａｎｄｌａｓｅｒｂｒｅｅｄｉｎｇａｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＭｕｔａｔｉｏｎｂｒｅｅｄｉｎｇＳｐａｃｅｉｎｄｕｃｉｎｇＩｏｎｂｅａｍｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎＬａｓｅｒｉｎｄｕ２００７年第２期世纪的工业微生物育种工作中起着很重要的作用。

但是，长期、重复使用某种诱变源，往往导致突变率低、突变谱窄和抗性饱和。

因此，一些新型、高效的诱变方法应运而生。

如空间诱变、离子注入诱变、激光诱变等新型、高效的微生物诱变育种技术。

它们不仅操作简单、安全，而且具有突变谱宽和在一定程度上能克服菌种对传统诱变源的抗性饱和等优点，一经开发就很快得到广泛的应用［５￣７］。

１空间诱变育种１９６０年美国、前苏联率先开展空间诱变研究，随后德国、日本也相继开始了空间诱变机理及其应用研究。

我国自１９８６年开始利用返回式卫星、高空气球等，也广泛开展了农作物、微生物、动物等空间诱变育种研究。

近年来，空间诱变技术的研究进展迅速，已涉及到形态学、细胞学、生理生化、分子生物学等领域，并已开始进行地面模拟失重实验。

１．１空间诱变育种技术及其特点空间诱变育种又称航天育种或太空育种，是指利用返回式卫星、飞船或高空气球将生物材料搭载到太空，利用太空特殊的环境（空间宇宙射线、微重力、高真空、弱磁场等因素）对生物材料进行诱变，再返回地面选育新种质、新材料，培育新品种的生物育种新技术。

无论是返回式卫星还是飞船和高空气球，其在高空条件下的微重力水平、真空度、质子、电子辐射含量均较高。

其到达高度的大气结构、气温、空气密度、压力、地磁强度、辐射流均与地面有很大差异。

另外，还有强烈的紫外线照射等。

这些空间条件都有可能引起微生物发生遗传性变异［８，９］。

空间突变的最大特点是突变频率高、突变谱广、变异幅度大、变异性状稳定快从而使育种周期缩短、生物安全性提高［５］。

１．２空间诱变育种技术的机理空间环境的主要特征是空间辐射、微重力、超真空和超净环境等。

ＶａｕｌｉｎａＥＮ［１０］等用绿藻为材料发现，空间环境使绿藻细胞的成活率降低，细胞生长延迟，但可使突变率提高。

一般认为太空辐射和微重力是空间育种的主要诱变因素。

空间辐射的主要来源有地球磁场捕获高能粒子产生的俘获带辐射，太阳外突发性事件产生的银河宇宙射线和太阳爆发产生的太阳粒子事件等［８］。

卫星飞行空间存在的各种宇宙射线是有效的诱变源。

ＴｓｕｔｏｍｕＦｕｋｕｄａ等发现，空间搭载的细菌核糖体蛋白Ｌ基因（ｒｐｓＬ），经４０ｄ的空间飞行后，受空间辐射ＬＥＴ的强烈作用，发生了序列消除，其变异频率是地面对照的２￣３倍［１１］。

ＧｅｏｒｇｅＫ［１２］等发现空间辐射的高ＬＥＴ可使染色体异常增加并使细胞有丝分裂延迟从而诱使突变产生。

ＨｏｒｎｅｃｋＧ［１３］等以Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ为材料，发现受宇宙强紫外线辐射，孢子的ＤＮＡ链断裂，致使突变发生，存活率降低。

ＨａｈｎＡ［１４］发现空间辐射的重离子束可增加菌体基因的重组频率，微重力对其没有影响。

微重力是空间诱变的一个重要因素，它可提高生物体在空间辐射中的变异率和存活率［１５￣１７］。

Ｐｒｏｓｓ［１８］等提出了一个空间试验的设计方案来分析微重力环境对辐射的ＤＮＡ链断裂修复的影响。

结果表明，在微重力条件下，可提高微生物的辐射变异率；微重力环境可能干扰ＤＮＡ损伤修复系统的正常运作，即阻延或抑制ＤＮＡ断裂的修复。

ＫｏｂａｙａｓｈｉＹ［１９］等利用高度耐辐射的Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ进行微重力对辐射损伤的修复效应试验发现，太空微重力对在地面受到的γ射线辐射损伤也有修复作用。

实际上，空间搭载材料是处于近地面空间各诱变因素的复合作用之中的，包括高真空、卫星发射与着陆时强震动及其他未知因素等。

研究发现真空可以提高菌体变异率，并能增强菌体对辐射的敏感性［１３，２０］。

卫星发射与着陆时的加速度和强震动也能引起菌体染色体重组等遗传性变异［２１］。

１．３空间诱变在微生物育种上的应用空间诱变技术可获得传统诱变难以得到的有益突变，从而明显改良微生物某些发酵特性（表１）。

随着空间诱变机理研究的深入，这一技术将会更好的为微生物育种服务。

表１空间诱变在微生物育种上的应用汪杏莉等：工业微生物物理诱变育种技术的新进展１１５生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２００７年第２期２离子注入诱变育种２０世纪８０年代中期，受离子注入材料表面改性研究的启发，中国科学院等离子体研究所的余增亮尝试将离子注入技术用于农作物品种改良并取得重大成功，从此开创了离子注入诱变育种技术。

２．１离子注入诱变技术的特点及作用机理离子注入对生物体的诱变作用就是荷能离子束本身所具有的质量、能量和电荷对生物体所产生的直接作用，其中包括能量沉积、质量沉积、电荷中和和交换、电子溅射、离子溅射等作用。

除此之外，通过直接作用在生物体内所产生的自由基或特殊的化学物质再对生物体产生间接的作用，也会引起细胞内的遗传物质发生变异。

离子束对生物体的直接作用和间接作用相结合从而引起生物体的染色体重复、易位、倒位或ＤＮＡ分子断裂、损伤、碱基缺失等多种生物学效应，致使被注入生物体发生遗传性变异［６］。

由于离子束有不同于紫外、γ射线、Ｘ射线的特殊三因子效应而使它与生物体相互作用过程相当复杂，比单一能量的紫外、γ射线、Ｘ射线等辐射具有更广泛的生物学效应。

在低剂量范围内，经紫外、γ射线、Ｘ射线等传统的诱变技术诱变所得的菌体存活曲线是，随着剂量的增加，呈现指数型或肩型下降，而离子注入诱变的存活曲线则为先降后升再降的“马鞍型”，可在较高的注入剂量下，保持较高的突变率和存活率，大大增加突变谱。

离子与生物体相互作用其能量沉积可形成一个相对电离密度很高的电离峰，即Ｂｒａｇｇ峰，如果Ｂｒａｇｇ峰停留在被作用生物体的遗传物质上时，则引起遗传物质ＤＮＡ的断裂与重接，从而引起基因变异。