酶法协同微波提取桑椹多糖工艺优化的研究

酶法协同微波提取桑椹多糖工艺优化的研究

杨桦;邝思碧;邹宇晓;黎尔纳;王弘

【摘 要】桑椹是我国传统的药食两用植物资源,其中的多糖物质与桑椹抗衰老、降血糖及护肝等生物活性密切相关.以桑椹为原料,建立酶法协同微波提取桑椹多糖的最佳工艺.通过单因素分析和Box-Behnken响应面设计,以桑椹多糖提取率为指标,考察酶的种类、酶液添加量、微波时间和微波功率等因素对其提取得率的影响.试验结果表明,酶法协同微波提取桑椹多糖的最佳工艺为:纤维素酶添加量9 mL(1000

U/mL),微波时间54 s,微波功率600 W,在此条件下桑椹多糖的提取率为3.01 %.%Mulberry is a traditional medicine and edible plant resource in

China, and the polysaccharide in mulberry is related to the biological

activity of anti-aging, hypoglycemic and liver protection. In this

study,mulberry was used as the raw material, and the extraction

technology of polysaccharides from mulberry was ex-tracted by enzyme-microwave assisted method. The single factor test and the Box-Behnken

response surfacewere used to optimize the extracting conditions. Targeted

as the rate of mulberry polysaccharide, enzyme, en-zyme addition,

microwave time and microwave power were studied. The results showed

that the enzyme-microwave assisted optimum conditions were as follows:

cellulase addition was 9 mL (1 000 U/mL), microwavetime was 54 s and

microwave power was 600 W. The maximum polysaccharide rate was 3.01 %

under the aboveconditions.

【期刊名称】《食品研究与开发》 【年(卷),期】2018(039)010

【总页数】6页(P32-37)

【关键词】桑椹多糖;酶法水解;微波提取;响应面分析;工艺优化

【作 者】杨桦;邝思碧;邹宇晓;黎尔纳;王弘

【作者单位】华南农业大学食品学院,广东广州510642;广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,农业部功能食品重点实验室,广东省农产品加工重点实验室,广东广州510610;广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,农业部功能食品重点实验室,广东省农产品加工重点实验室,广东广州510610;广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,农业部功能食品重点实验室,广东省农产品加工重点实验室,广东广州510610;广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,农业部功能食品重点实验室,广东省农产品加工重点实验室,广东广州510610;华南农业大学食品学院,广东广州510642

【正文语种】中 文

桑椹在我国食用历史悠久，已被列入首批“药食同源”名单[1-2]。桑椹营养丰富且富含多糖、多酚、生物碱和挥发性油等功能物质，具有降血糖、降血脂、增强免疫力和抗肿瘤[3]等活性作用，深入的研究发现并证实桑椹多糖是上述活性的重要物质基础[4-5]。

多糖（polysaccharide）是一类复杂的糖类物质，广泛存在于微生物、植物的细胞壁和动物的细胞膜中。马明兰等[6]采用沸水浸提法提取桑椹多糖，精制桑椹多糖提取率可达到2.63%。有研究表明桑椹多糖有抗衰老、降血糖和护肝的功效[7]。自由基学说认为：衰老可能与代谢过程中连续产生的自由基的摧毁性连锁反应有密切关系[8]。杨联河[9]通过实验发现，桑椹多糖可显著提升衰老模型小鼠红细胞超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和全血谷胱甘肽过氧化物酶活性水平（P≤0.05），显著降低衰老模型小鼠血浆、脑匀浆及肝匀浆中过氧化脂质的含量（P≤0.05）。桑椹多糖的摄入可显著升高酒精性肝损伤模型小鼠肝脏超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性，同时降低血液谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平（P≤0.05），有效改善小鼠肝损伤状况，推测桑椹多糖对酒精性肝损伤的抑制作用可能与抗氧化机制相关[10]。传统桑椹多糖提取采用水提法，需要多次重复浸提多糖才得以释放，操作时间长，得率低。酶法提取和超声波提取是近年来发展较快的提取方法，具有提取时间短和能耗低的特点[11-12]。

本试验针对单一的酶法提取或超声波提取桑椹多糖提取率不高的问题，拟结合生物酶法和物理场处理技术，通过单因素试验与Box-Behnken设计法对桑椹多糖提取工艺进行优化，进而确定桑椹多糖的最佳提取工艺，为桑椹多糖功能食品研究提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

桑椹干：采摘八、九成熟的新鲜桑椹，放置于60℃烘箱中烘干，食品级包装袋真空包装后置于-20℃冰箱中保存备用；纤维素酶（1 800 U/mg）、果胶酶（1 000

U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）：广州市齐云生物技术有限公司；浓硫酸、苯酚、葡萄糖、无水乙醇：分析纯，广州化学试剂厂。

SQP型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HWS26型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；WD750B型微波炉：顺德格兰仕电器厂有限公司；FW100型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；UV-1800型紫外可见分光光度计：岛津企业管理（中国）有限公司；CR22G III型高速冷冻离心机：广东广州日立工机有限公司。 1.2 方法

1.2.1 桑椹粗多糖的提取工艺流程

桑椹→60℃烘干→粉碎（过20目筛）→称取桑椹粉末5 g→酶解（2.5 h，37℃）→微波萃取→减压抽滤→浓缩→四倍体积无水乙醇醇沉→4℃过夜→离心（10 000

r/min，10 min）→去上清，加水溶解沉淀→定容至50 mL→桑椹粗多糖溶液[13]

1.2.2 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸比色法，吸取一定体积的葡萄糖标准溶液，依次定容至2 mL；精密吸取桑椹粗多糖溶液1.25 mL，加水稀释至50 mL。分别取葡萄糖标准液稀释液、桑椹多糖稀释液1.0 mL于10 mL试管中，再取1.0 mL蒸馏水作为空白对照，分别加入5%苯酚溶液1.0 mL，再加入浓硫酸5.0 mL，混合均匀，室温静置30

min，490 nm下测其吸光值。

1.2.2.1 葡萄糖标准溶液的配制

精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖500 mg，加少量蒸馏水溶解，转移至500

mL容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，即得浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

1.2.2.2 标准曲线的绘制

吸取葡萄糖标准液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，定容至25 mL，得到不同浓度的葡萄糖稀释液，分别取1.0 mL稀释液于试管中，按2.2.4的操作显色，于490nm处测定吸光值。以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=0.009 2C+0.044 6，R2=0.990 7。

1.2.2.3 桑椹多糖提取率的计算

多糖提取率/%=（C×V×D）/（W×106）×100

式中：C为测得的样品溶液稀释液的多糖浓度，μg/mL；V为样品溶液稀释液的体积，mL；D为样品溶液的稀释倍数；W为样品的质量，g。

1.2.3 单因素试验 1.2.3.1 酶的种类对多糖提取率的影响

研究选取3种酶进行试验：果胶酶、胃蛋白酶和纤维素酶。分别称取果胶酶0.05

g，胃蛋白酶0.016 7 g，纤维素酶0.027 8 g，加少量蒸馏水溶解，分别定容至50 mL，配制成酶活力均为1 000 U/mL的酶液，4℃保存备用。

称取5 g桑椹粉置于锥形瓶中，分别加入相同体积5mL的3种不同酶液，与未加酶进行空白对照，并按料液比1∶25（g/mL）补齐蒸馏水，37℃水浴酶解2.5 h，100℃灭酶10 min，提取多糖后测量并计算多糖含量。

1.2.3.2 酶添加量对多糖提取率的影响

分别加入 0、1、3、5、7、9 mL 的纤维素酶液，37 ℃水浴酶解2.5 h，100℃灭酶10 min，研究不同酶液添加量对多糖提取率的影响。

1.2.3.3 微波处理时间对多糖提取率的影响

加入7 mL纤维素酶液，37℃水浴酶解2.5 h，100℃灭酶10 min。在微波功率为450 W，研究不同微波时间（30、60、90、120、150 s）对多糖提取率的影响。

1.2.3.4 微波功率对多糖提取率的影响

加入7 mL纤维素酶液，37℃水浴酶解2.5 h，100℃灭酶10 min。在微波时间为60 s，研究不同微波功率（150、300、450、600、750 W）对多糖提取率的影响。

1.2.4 响应面法对桑椹多糖提取条件的优化

综合单因素提取多糖的试验结果，根据Box-Benhnken[14]的中心组合试验设计原理，采用响应面法在三因素三水平上的响应面分析方法对工艺参数进行优化[15-16]。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface

methodology水平 X1纤维素酶添加量/mL X2微波时间/s X3微波功率/W-1 5

30 450 0 7 60 600 1 9 90 750 2 结果与讨论

2.1 单因素试验各因素对多糖提取率的影响

2.1.1 酶的种类对多糖提取率的影响

酶的种类对多糖提取率的影响见图1。

图1 酶的选择对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of different kinds of enzymes

on the polysaccharides extraction rate图中不同字母代表不同处理组有显著差异（P≤0.05）。

由图1可知，与空白对照组相比，经纤维素酶处理后桑椹多糖提取率显著增加（P≤0.05），多糖提取率达到2.31%。果胶酶组的多糖提取率略有增高，但与对照组差异不显著（P≥0.05）。添加胃蛋白酶处理的桑椹对多糖提取率无明显影响。由于桑椹的细胞壁主要是由纤维素构成的，纤维素酶的处理可以破坏细胞壁中β-D-葡萄糖苷键，促进细胞壁中多糖的释放。据此，选择纤维素酶作为提取桑椹多糖所用的酶。

2.1.2 酶添加量对多糖提取率的影响

酶添加量对多糖提取率的影响见图2。

由图2可知，纤维素酶液的添加量从1 mL～7 mL（1 000 U/mL）范围内，随着酶添加量的增加，多糖提取率显著增加（P≤0.05），呈显著的量效关系，其中在7mL时达到2.42%。进一步将酶添加量增加到9 mL时，多糖提取率略有下降，这可能是桑椹多糖已基本提取完全，其它杂质进入提取液，使提取液黏度升高，扩散速度变慢，导致多糖不易溶出，酶量的增加对多糖有一定的抑制作用。因此选择纤维素酶的最佳添加量为7mL。