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仙鹤草中鞣质类成分的提取分离鉴定实验

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山　东　化　工

收稿日期：２０１９－０４－０９

基金项目：山东中医药大学大学生研究训练计划项目（项目号：２０１８０６８）

作者简介：孟凡恒（１９９７—），女，山东济宁人，山东中医药大学药学院，主要从事中药化学方面的研究。仙鹤草中鞣质类成分的提取分离鉴定实验

孟凡恒１，李佳佳１，董兴童２，李书凝３

（１．山东中医药大学药学院，山东济南　２５０３５５；２．山东中医药大学中医学院，山东济南　２５０３５５；

３．山东中医药大学理工学院，山东济南　２５０３５５）

摘要：仙鹤草（ＡｇｒｉｍｏｎｉａｐｉｌｏｓａＬｅｄｅｂ．）是蔷薇科龙芽草属多年生草本植物。因鞣质类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫力等药理作用，因此研究仙鹤草中鞣质成分对于充分开发利用仙鹤草资源有着重要的意义。方法：本实验采用乙醇减压回流提取法获得仙鹤草中含有的鞣质成分，通过大孔树脂与硅胶层析法对鞣质进行富集、分离，应用化学方法和高效液相色谱法对其进行鉴定。结果：９０％乙醇进行提取，１５倍量的６０％乙醇可以洗脱出鞣质，样品６的峰５为目标化合物，方法安全简便，重复性稳定性好。关键词：仙鹤草；鞣质；提取；分离；鉴定；高效液相色谱法中图分类号：ＴＱ４６１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０２１Ｘ（２０１９）１３－００１０－０４

ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｏｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴａｎｎｉｎｓ

ｆｒｏｍＡｇｒｉｍｏｎｉａＰｉｌｏｓａ

ＭｅｎｇＦａｎｈｅｎｇ１，ＬｉＪｉａｊｉａ１，ＤｏｎｇＸｉｎｇｔｏｎｇ２，ＬｉＳｈｕｎｉｎｇ３

（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｎａｎ　２５０３５５，Ｃｈｉｎａ；

２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｎａｎ　２５０３５５，Ｃｈｉｎａ；

３．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｎａｎ　２５０３５５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＡｇｒｉｍｏｎｉａｐｉｌｏｓａＬｅｄｅｂ．ｉｓａｐｅｒｅｎｎｉａｌｈｅｒｂｏｆＲｏｓａｃｅａｅ．Ｂｅｃａｕｓｅｔａｎｎｉｎｓｈａｖｅｔｈｅｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓ

ｏｆａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ，ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎａｎｄｅｎｈａｎｃｉｎｇｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｉｔｉｓｏｆｇｒｅａｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｔａｎｎｉｎｓｉｎＨｅｒｂａＡｇｒｉｍｏｎｉａｅｆｏｒ

ｔｈｅｆｕｌｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＨｅｒｂａＡｇｒｉｍｏｎｉａｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｔａｎｎｉｎｓｉｎＨｅｒｂａＡｇｒｉｍｏｎｉａｅｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙ

ｅｔｈａｎｏｌｄｅｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｆｌｕｘ．Ｔｈｅｔａｎｎｉｎｓｗｅｒｅｅｎｒｉｃｈｅｄａｎｄｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎａｎｄｓｉｌｉｃａｇｅｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．

Ｔｈｅｔａｎｎｉｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄａｎｄｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｔａｎｎｉｎｓｃｏｕｌｄｂｅｅｌｕｔｅｄ

ｂｙ９０％ｅｔｈａｎｏｌｗｉｔｈ１５ｔｉｍｅｓｏｆ６０％ｅｔｈａｎｏｌ．Ｔｈｅｐｅａｋ５ｏｆｓａｍｐｌｅ６ｗａｓｔｈｅｔａｒｇｅｔｃｏｍｐｏｕｎｄ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｓａｆｅ

ｗｉｔｈｇｏｏｄｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＡｇｒｉｍｏｎｉａｐｉｌｏｓａＬｅｄｅｂ．；ｔａｎｎｉｎｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＨＰＬＣ

仙鹤草是蔷薇科、龙芽草属多年生草本植物。其性味苦，

涩，平；归心、肝经；具有收敛止血，截疟，止痢，解毒，补虚的功

效［１］。现代研究证明鞣质类成分是仙鹤草的主要有效成分之

一［２］，本实验拟采用溶剂提取法中的乙醇减压回流提取法获得

仙鹤草的乙醇提取物，再综合运用层析法对目标化合物进行富

集、分离，应用化学方法和高效液相法进行鉴定。

１　实验仪器与试剂

ＤＦＹ－５００型５００ｇ摇摆式高速中药粉碎机（温岭市林大

机械有限公司），ＢＳ２１４Ｄ型１／１万分析电子天平（北京

Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司），ＢＴ２５Ｓ型１／１０万分析电子天平（北京Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ

公司），ＳＺＣＬ－２－５０００ｍＬ型磁力搅拌器（巩义市予华仪器有

限责任公司），层析柱（３０×５００ｍｍ），旋转蒸发器（巩义市予华

仪器有限责任公司），高效液相色谱仪（品牌：岛津；型号：ＬＣ－

１０ＡＴＶＰ）。

仙鹤草（北京同仁堂亳州饮片有限责任公司，产品批号：

７０１００２０１３）经山东中医药大学药学院李慧芬副教授鉴定该饮

片为蔷薇科植物龙芽草属仙鹤草ＡｇｒｉｍｏｎｉａｐｉｌｏｓａＬｅｄｅｂ．的全

草，没食子酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，产品批号：

ＹＮ１１０５ＭＡ１４），丹宁酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，产

品批号：２０１８０５２９），ＮＫＡ－９型大孔树脂（上海源叶生物科技有

限公司），硅胶（青岛海洋化工有限公司），ＣＭＣ－Ｎａ（国药集团

化学试剂有限公司），乙醇，苯，乙酸乙酯，甲酸，甲醇（色谱纯，

其余均为分析纯）。２　实验步骤

２．１　仙鹤草有效成分鞣质的提取

２．１．１　仙鹤草乙醇提取物的制备

将原饮片仙鹤草用中药粉碎机粉碎，得到粒径大小为２～４

ｍｍ的药品颗粒，使其与乙醇试剂充分接触反应，取粉碎后的药品２００ｇ，置５０００ｍＬ圆底烧瓶中，加入９０％乙醇１０００ｍＬ浸泡

３ｄ，温度控制在４５～５０℃条件下减压回流提取２ｈ［３］，抽滤分离药渣和提取液，弃去药渣。将提取液倒入圆底烧瓶，在４８℃

条件下减压回收乙醇，回收至提取液剩余约８０ｍＬ，抽滤去除难溶于水的杂质，滤液自然冷却后加蒸馏水稀释至３００ｍＬ密封

保存备用，得仙鹤草的乙醇提取物，记为试剂Ａ。

２．１．２　仙鹤草乙醇提取物的定性分析

分别取试剂Ａ１ｍＬ于两个试管中，记为试管ｍ、ｎ，试管ｍ

中滴加４％明胶水溶液，出现沉淀，证明滤液中含有鞣质；试管ｎ滴加２～３滴３％三氯化铁溶液，溶液变为深蓝色，证明溶液中

含有邻三酚羟基化合物，存在水解鞣质和没食子儿茶酸缩合鞣质［３］。

２．２　仙鹤草乙醇提取物成分的分离

取２００ｍＬ试剂Ａ，分别用１０００ｍＬ６０％乙醇溶液、１０００ｍＬ７０％乙醇溶液、１０００ｍＬ８０％乙醇溶液在ＮＫ－９型大孔树脂

中进行梯度洗脱，分别得到样品１、样品２、样品３，用３％三氯化铁溶液进行成分鉴别反应，样品１显阳性，样品２和样品３显阴

性。·０１·ＳＨＡＮＤＯＮＧＣＨＥＭＩＣＡＬＩＮＤＵＳＴＲＹ ２０１９年第４８卷　第１３期

采用湿法装柱，湿法上样，用硅胶色谱柱对样品１内的成

分进行进一步分离提取，用５倍样品体积６０％乙醇溶液进行洗

脱，得到样品４、样品５、样品６、样品７，即为供试溶液。

２．３　仙鹤草乙醇提取物的色谱检识

２．３．１　薄层层析法检测鞣质类成分

２．３．１．１供试品与对照品的制备

供试品：取试剂Ａ１ｍＬ于试管中，记为Ｐ。

对照品：精密量取对照品没食子酸０．００７００ｇ，置于１０ｍＬ

棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得各自的对照品溶

液，记为Ｑ，没食子酸对照品：０．７００ｍｇ／ｍＬ。

２．３．１．２薄层层析方法

展开板硅胶Ｇ加０．６％ＣＭＣ－Ｎａ，手工制板，晾干，１０５℃

活化１ｈ。点样：Ｐ、Ｑ。展开剂∶Ｖ（苯）∶Ｖ（乙酸乙酯）∶Ｖ（甲酸）

＝８０∶５０∶８。展开方式为卧式上行［４］。２．３．１．３薄层层析结果

经薄层展开后，置２５４ｎｍ紫外灯下检视，没食子酸斑点显

蓝紫色荧光。喷醋酸－亚硝酸钠－氢氧化钠显色剂，没食子酸

斑点显亮黄绿色。说明供试品中含有可水解鞣质。

２．３．２　高效液相法检测仙鹤草乙醇提取物

２．３．２．１对照品溶液的制备

精密量取对照品没食子酸０．００３５０ｇ，丹宁酸０．００３９１ｇ，分

别置于１０ｍＬ棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得各

自的对照品溶液，没食子酸对照品：０．３５０ｍｇ／ｍＬ，丹宁酸对照

品：０．３９１ｍｇ／ｍＬ。

２．３．２．２色谱条件

流动相：６０％甲醇，流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ，进样量：４０μＬ，柱温：

３０℃，检测波长：２１０ｎｍ。得到波谱数据见图１～５以及表１

～４。

图１　没食子酸对照品的高效液相色谱图

图２　丹宁酸对照品的高效液相色谱图·１１·孟凡恒，等：仙鹤草中鞣质类成分的提取分离鉴定实验山　东　化　工

表１　没食子酸和丹宁酸对照品的ＨＰＬＣ分析结果

峰号试剂保留时间／ｍｉｎ峰高峰面积含量／％

００００没食子酸对照品４．１０７６８８２１８．１２５１４４００５１８１００

０００１丹宁酸对照品３．５７３１４４９８０．０７８１６６２０２１．７５１００

表２　样品４的ＨＰＬＣ分析结果

试剂峰名保留时间／ｍｉｎ峰高峰面积含量／％

样品４１２．７６５３７８８４．０００７１７３２．８９８１．７６９１

２３．００７１６１６６２．５７８６２６８５０．０００１５．４５９５

３３．１４０３５４２２２．０００３３５６２１４．５００８２．７７１４

图３　样品４高效液相色谱图

表３　样品５的ＨＰＬＣ分析结果

试剂峰名保留时间／ｍｉｎ峰高峰面积含量／％

样品５１２．７６５３１４２０２．８９７２６０１２３８．３１４２１．４２２４

２３．０２３２９１０４２．５００２５６５４８０．８３８２１．１２８０

３３．１６５３８４７２３．０００５６３３２１４．０００４６．３９２２

４３．４０７２３３１４７．５６９１３４２６５１．５００１１．０５７４

图４　样品５高效液相色谱图·２１·ＳＨＡＮＤＯＮＧＣＨＥＭＩＣＡＬＩＮＤＵＳＴＲＹ ２０１９年第４８卷

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仙鹤草中化学成分的研究进展

仙鹤草中化学成分的研究进展

2014年度本科生毕业论文（设计）

仙鹤草中化学成分的研究进展

院 － 系： 理学院化学系

专 业： 化 学

年 级： 2011级

学生姓名： 何宣鹏

学 号： 201101020132

导师及职称： 王泽锋

2014年4月 2014 Annual Graduation Thesis (Project) of the College Undergraduate

Research progress in chemical

constituents of Agrimonia pilosa

Department: Dpartment of Chemistry, School of Science

Major: Chemistry

Grade: 2011

Student’s Name: He Xuanpeng

Student No.: 201101020132

Tutor: Wang Zefeng

April, 2014仙鹤草中化学成分的研究进展

何宣鹏

红河学院理学院化学系2011级 蒙自 661100

摘要

本人在查阅了大量文献之后，对仙鹤草中化学成分的研究进展进行总结，化学成分分为十二类概述，其成分主要为酚类、黄酮类、糖苷类、三萜类及皂苷类、有机酸、酯类、挥发油、甾体类、鞣质类、多糖、微量元素成分等化合物以及新发现的化合物。

关键词：仙鹤草；化学成分；研究

Research progress in chemical constituents of Agrimonia

大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定

大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定

大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定

大黄中游离蒽醌类成分的提取、分离与鉴定

一、实验目的

1.掌握蒽醌苷元的提取方法--双相酸水减法

2.掌握梯度PH萃取法提取分离大黄中各种蒽醌苷元的原理及操作方法 3.掌握羟基蒽醌类化合物的颜色反应及薄层色谱鉴别方法

二、实验原理

1.提取原理

双向酸水解法，为一相与酸水不相互溶的有机溶剂，另一相为酸水，加热回流水解的方法。由于大黄中的羟基蒽醌类化合物多以苷的形式存在，所以首先要将苷水解成苷元，本实验选用硫酸和乙酸乙酯作为双向酸水解的溶剂，采用加热回流方法，提取大黄药材中的游离蒽醌类化合物。根据苷元不溶于水，可溶于乙醚、乙酸乙酯等亲脂性有机溶剂的性质，即在加热回流提取过程中，稀硫酸可将蒽醌苷元水解成苷元，游离出来的蒽醌苷元随即溶于乙酸乙酯中，从而将蒽醌苷元提取出来。 2.分离原理

pH梯度萃取法 羟基蒽醌类化合物酸性强弱不同，用pH梯度法进行分离。具有羧基或多个β位酚羟基的蒽醌可溶于5%碳酸氢钠溶液；具有一个β位酚羟基的蒽醌可溶于5%碳酸钠溶液；只具有α位酚羟基的蒽醌，酸性弱，只溶于氢氧化钠溶液。以分离酸度不同的蒽醌苷元。也可利用游离蒽醌的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离。

（1）大黄中游离蒽醌的酸性强弱顺序 大黄酸（-COOH）＞大黄素（β酚-OH）＞芦荟大黄素（醇-OH）＞大黄素甲醚（-OCH3）≈大黄酚（-CH3）

（2）大黄中游离蒽醌的极性大小顺序 大黄酸＞大黄素＞芦荟大黄素＞大黄素甲醚＞大黄酚

大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，但极性不同，可用硅胶柱色谱法进行分离。

三、实验方法

四、 1.总蒽醌苷元的提取、分离工艺流程 大黄药材（粗粉）50g

加20%H2SO4 100ml，乙酸乙酯250ml，水浴回流2h，稍冷过滤

实验四 大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定

实验四 大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定

实验四 大黄中游离蒽醌类成分的提取、分离与鉴定

一、概述

植物来源：大黄系蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L．)、唐古特大黄(Rheum

tanguticum Maxim. ex Balf．)或药用大黄(Rheum offcinale Baill．)的干燥根及根茎。大黄记载于《神农本草经》等许多文献中，具有泻下、健胃、清热解毒等功效。自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一味很早就被各国药典收载的世界性药材。

功效：大黄具有多方面的生物活性，其抗菌、抗感染及抗肿瘤活性有效成分主要为蒽醌类衍生物，如：大黄酸、大黄素和芦荟大黄素；止血的主要有效成分为大黄酚；泻下的有效成分是结合型的蒽苷类。蒽醌类衍生物占大黄总化学成分的3％～5％，该类成分少部分以游离状态存在，大部分与葡萄糖结合成苷的形式存在。此外，大黄还含有鞣质等多元酚类化合物，含量在10％一30％之间，具止泻作用，与蒽苷的泻下作用恰恰相反。

主要化学成分的结构及物理性质 大黄中含有多种游离的羟基蒽醌及其与糖所形成的苷类化合物，已知的游离羟基蒽醌主要有以下5种化合物。

大黄酸(rhein)，C15H806，黄色针晶，m.p321—322℃(330℃分解)，UVλmax431，258，231，204。可溶于碱水，微溶于乙醇、苯、三氯甲烷、乙醚和石油醚，不溶于水。

大黄素(emodin)，C15H1005，橙黄色针晶(乙醇)，m.p256—257℃。UVλmax436，289，266，253，222。可溶于碱水，微溶于乙醚、三氯甲烷，不溶于水。

芦荟大黄素(aloe emodin)，橙色针晶(甲苯)，m.p223～224℃。UVλmax429，287，254，225，202。可溶于乙醚、苯及碱水，不溶于水。

大黄素甲醚(physcion)，砖红色单斜针状结晶(苯)，m.p205—207℃。溶于苯、三氯甲烷及甲苯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮，不溶于水。

实验四--大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定

实验四--大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定

实验四 大黄中游离蒽醌类成分的提取、分离与鉴定

一、概述

植物来源：大黄系蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L．)、唐古特大黄(Rheum

tanguticum Maxim. ex Balf．)或药用大黄(Rheum offcinale Baill．)的干燥根及根茎。大黄记载于《神农本草经》等许多文献中，具有泻下、健胃、清热解毒等功效。自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一味很早就被各国药典收载的世界性药材。

功效：大黄具有多方面的生物活性，其抗菌、抗感染及抗肿瘤活性有效成分主要为蒽醌类衍生物，如：大黄酸、大黄素和芦荟大黄素；止血的主要有效成分为大黄酚；泻下的有效成分是结合型的蒽苷类。蒽醌类衍生物占大黄总化学成分的3％～5％，该类成分少部分以游离状态存在，大部分与葡萄糖结合成苷的形式存在。此外，大黄还含有鞣质等多元酚类化合物，含量在10％一30％之间，具止泻作用，与蒽苷的泻下作用恰恰相反。

主要化学成分的结构及物理性质 大黄中含有多种游离的羟基蒽醌及其与糖所形成的苷类化合物，已知的游离羟基蒽醌主要有以下5种化合物。

大黄酸(rhein)，C15H806，黄色针晶，m.p321—322℃(330℃分解)，UVλmax431，258，231，204。可溶于碱水，微溶于乙醇、苯、三氯甲烷、乙醚和石油醚，不溶于水。

大黄素(emodin)，C15H1005，橙黄色针晶(乙醇)，m.p256—257℃。UVλmax436，289，266，253，222。可溶于碱水，微溶于乙醚、三氯甲烷，不溶于水。

芦荟大黄素(aloe emodin)，橙色针晶(甲苯)，m.p223～224℃。UVλmax429，287，254，225，202。可溶于乙醚、苯及碱水，不溶于水。

大黄素甲醚(physcion)，砖红色单斜针状结晶(苯)，m.p205—207℃。溶于苯、三氯甲烷及甲苯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮，不溶于水。