叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定分光光度法

叶绿素是植物和一些原生生物中重要的光合色素之一，它在光合作用中起到接收和转换光能的关键作用。测定叶绿素含量可以帮助我们了解植物的光合效率和健康状况，以及研究光合作用的机制和调控。分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法，本文将介绍该方法的原理、实验步骤和数据分析。

一、原理

分光光度法测定叶绿素含量的原理是基于叶绿素对光的吸收特性。叶绿素分子可以吸收特定波长的光，特别是蓝光和红光，而对绿光的吸收较弱。利用分光光度计测量叶绿素溶液在不同波长的光下的吸光度，可以通过比较吸光度与叶绿素浓度的标准曲线，计算出待测样品中叶绿素的含量。

二、实验步骤

1. 制备叶绿素提取液：将适量的鲜叶片（去除茎和大的叶脉）放入离心管中，加入少量酒精，并用研钵捣碎，使叶绿素释放到酒精中。然后用酒精将研钵中的残渣洗入离心管中，最后用酒精将叶绿素完全溶解。注意，酒精的使用要避免火源。

2. 离心沉淀：将叶绿素提取液离心10分钟，以沉淀残渣和悬浮物。

3. 分光光度计测量：取离心后的叶绿素提取液，用分光光度计在特定波长下（如645 nm和663 nm）测量其吸光度。记录吸光度值。

4. 制备标准曲线：取不同浓度的叶绿素标准溶液，用同样的方法测量其吸光度，记录吸光度值。

5. 计算叶绿素含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。

三、数据分析 1. 标准曲线的绘制：将各个标准溶液的叶绿素浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制曲线。利用标准曲线可以通过待测样品的吸光度值，反推出其叶绿素的浓度。

2. 计算待测样品中叶绿素的含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。

四、注意事项

1. 实验中应尽量避免阳光直射，以免光线对实验结果的干扰。

2. 操作时应注意安全，避免酒精接触到火源。

3. 叶绿素提取液的制备应充分溶解，避免残渣和悬浮物的影响。

叶绿素含量测定方法---丙酮法

由于微藻的生长周期比较复杂，包括无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，其在不同阶段的生理形态不同，有时藻细胞会聚集在一起，以片状或团状形式存在，在显微镜下难以确定其所包含的细胞数量。

藻细胞中叶绿素的含量（特别是叶绿素a的含量）通常随与细胞的生长呈较好的线性关系，因此可通过测定藻细胞中叶绿素含量变化来反映微藻的生长情况。

叶绿素测定采用丙酮研磨提取法。

取适量藻液于10 mL离心管中在4000 rpm转速下离心10 min，弃去上清液，藻泥中加入适量的100 %的丙酮。采用丙酮提取法时在试管研磨器中冰浴研磨5

min，4000 rpm离心后，上清液转入10 mL容量瓶中。按上述方法对藻体沉淀进行萃取，直至藻体沉淀呈白色为止。定容后，采用722S型可见分光光度计分别测定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，叶绿素含量用以下公式进行计算（Amon,1949）：

叶绿素a含量用以下公式进行计算：

Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数

叶绿素b含量用以下公式进行计算：

Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数

叶绿素总含量用以下公式进行计算：

Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数

由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失。

叶绿素提取方法

提取液：本试验用DMSO/80%丙酮(l/2，v/v)提取的叶绿素，谭桂英 周百成 底栖绿藻叶绿素的二甲基亚砜提取和测定法* 海洋与湖沼 1987 18（3）295--300.

一、直接浸提法：

1、准确量取10ml藻液,加到15ml离心管中，放在台式离心机离心，3500r/min（根据不同的藻选择不同那个的离心转速）离心5min倒上清；留藻泥。随后在盛有藻泥的离心管中加入蒸馏水，与藻泥混匀后再次离心，目的是除去藻细胞表面的盐份，此清洗过程重复三次。

叶绿素含量测定仪对叶绿素含量的测定

有相关资料表明，叶绿素是高等植物和其它所有能进行光合作用的生物体含有的一类绿色色素。而植物叶片中的叶绿素含量则能够反映植物本身的状况，一般而言，叶绿素含量高的植物，作物光合作用就会增强，各种物质的合成能力也会增强，促使养分吸收加快，作物生长迅速，膨果快；于此同时，叶绿素含量的高低也能客观地反映植物抗病性的强弱。因此，在植物生理研究中，测叶绿素含量对于试验研究来说具有非常重要的意义。那么，测叶绿素的仪器叫什么呢？叶绿素含量测定仪。

叶绿素含量测定仪是一款专门用来检测叶绿素含量的仪器，该仪器的检测原理是通过测量叶片在两种波长范围内的透光系数来确定叶片当前叶绿素的相对数量，也就是在叶绿素选择吸收特定波长光的两个波长区域，根据叶片透射光的量来计算测量值。叶绿素含量测定仪的测量方法很简单，操作人员只需要手持叶绿素含量测定仪，将叶片插入仪器的感应部位，然后合上测量探头即可。这种测量方法还有一大好处就是，不会对叶片造成损伤，可以实现无损快速测量，尤其是在作物的生长过程中全程对特定的叶片进行监测，可以得到更科学的分析结果。

在文章开头我们也明确的提到，叶绿素含量的检测具有重要的意义，它可以反映植物的健康状况，比如说叶绿素含量少，我们可以了解到植物的病变，因为植物一旦产生病害会出现叶黄的现象，也就是病害会致使叶绿素解体，出现黄化的现象。而使用托普云农TYS-B叶绿素含量测定仪测定叶绿素的含量，可以及时了解植物的生长情况，并且也可以通过测量叶绿素的含量反应植物真实的硝基需求量，从而有利于合理的施加氮肥，提高氮的利用率，并可保护环境。

叶绿素含量测定方法

叶绿素是一种存在于植物和一些浮游植物中的绿色色素，其主要功能是吸收并转化太阳能，参与光合作用。叶绿素含量是评估植物光合能力和健康状况的重要指标，因此测定叶绿素含量对于研究植物生理学、生态学以及农业领域等具有重要意义。

目前，常用的测定叶绿素含量的方法主要有光谱法、色素提取法和光度法等。下面将介绍其中的几种常见方法。

1.光谱法

光谱法是通过测定叶绿素在特定波段下吸光度的变化来间接推算得到叶绿素含量的方法。不同波段吸光度值之间存在一定的线性关系，通过建立吸光度与叶绿素含量的标准曲线，可以快速准确地测定样品中的叶绿素含量。常见的仪器有分光光度计、近红外分析仪等。

2.色素提取法

色素提取法是将叶片中的色素溶解出来，然后根据提取溶液的吸光度或荧光强度来测定叶绿素的含量。常用的溶剂有乙醇、二甲基亚砜等。该方法具有简单、快速、操作方便等优点，但需要注意的是不同溶剂对叶绿素的提取效果可能不同，需要选择适合的溶剂。

3.光度法

光度法是直接测定叶绿素溶液的吸光度或荧光强度来推算叶绿素的含量。其中叶绿素吸光度法是通过测定在特定波长下叶绿素溶液的吸光度值，利用比色法或定量法来计算出叶绿素的含量；而叶绿素荧光法则是通过激发叶绿素分子产生荧光，然后测定荧光强度来推算叶绿素的含量。这两种方法操作简单，结果稳定可靠。

除了以上方法外，还有一些新的测定叶绿素含量的方法正在不断研究和发展，如高效液相色谱法、激光诱导荧光法等。这些方法具有高灵敏度、高分辨率、可同时测定多种色素等特点，适用于复杂体系和微量叶绿素的测定。

无论采用何种方法测定叶绿素含量，需要注意的是在测量前，应选择新鲜健康的叶片，避免叶片受损和老化对测量结果的影响；同时要控制样品之间的处理和测量条件的统一性，保证结果的准确性和可比性。

总之，叶绿素含量的测定方法有多种选择，根据实际需要选取合适的方法进行测定。这些方法可以应用于对植物的生长状态、光合能力以及环境胁迫的评估，对于植物生理研究和农业生产具有重要意义。