8.印迹杂交技术

杂交棉秋乐杂８号选育及高产栽培技术

摘要介绍杂交棉秋乐杂8号的选育过程、产量表现及特征特性,进一步分析其相关栽培措施,以期为该品种的推广提供科学依据。

关键词秋乐杂8号;选育过程;产量表现;特征特性;栽培技术

秋乐杂8号是河南农科院种业有限公司选育的高产、优质、抗病、早熟、单价转基因抗虫杂交棉花新品种,2007年通过河南省品种审定委员会审定(审定编号:豫审棉2007001)。同对照豫杂35相比,突出特点是铃大、产量高、品质优、抗枯萎病、抗虫性强,是未来黄淮棉区具有较大推广前景的一个杂交棉花新品种。

1亲本来源及选育过程

1.1制定育种目标

杂种优势是生物界的普遍规律,当前世界各国都把杂种优势的利用作为动植物育种的主要手段。要想进一步提高中国棉花的产量和品质,选育高产、优质、多抗的棉花杂交种是育种的目标之一[1]。为此,根据黄淮棉区生态特点和棉花生产实际需要制定了高产、稳产、早熟、优质、多抗的棉花育种目标。

1.2亲本选配

根据制定的棉花育种目标合理选配亲本。秋乐杂8号的亲本组合为QL16(母本)×GK12(父本)。母本QL16是用中19作母本,豫棉21作父本进行杂交,从F2中选择优异单株病圃鉴定种植F3,通过南繁北育,在F5中筛选、鉴定、优选其中第16个单株作株行,定名为QL16。该品系生育期132d,大株型,茎杆硬,植株塔型,果节中等,叶片中等大小,叶色绿,结铃性好,单铃重5.8g,衣分40%～42%,绒长31.8mm,比强度23.7～26.0cN/tex,马克隆值4.4～4.7。父本是从GK12系选而成的中早熟抗虫常规棉品种,生育期130d左右,出苗快,苗壮、苗齐,前期长势强,后期长势一般,整齐度好,结铃性强,吐絮肥畅易采收,抗棉铃虫,耐枯萎病、黄萎病,植株筒型,较紧凑,株高中等,果枝上举,叶深绿色,大小适中,皱褶明显,透光性好,铃卵圆形,铃嘴尖,单铃重5.3g,衣分40%,籽指11.6g,2.5%跨长29.4mm,比强度21.1cN/tex,麦克隆值4.7。

印迹杂交的操作流程和方法

印迹杂交的操作流程和方法主要包括以下步骤：

1. 酶切DNA：使用限制性内切酶消化DNA，产生大小不同的片段。

2. 凝胶电泳分离：通过凝胶电泳分离各酶切片段。

3. DNA原位变性：使DNA片段在原位变性，为后续的转移做好准备。

4. DNA转移：将DNA片段转移到固体支持物（如硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上，这一步也被称为印迹。

5. 预杂交滤膜：掩盖滤膜上非特异性位点，防止探针与非特异性位点结合。

6. 探针与同源DNA片段杂交：让同位素标记的探针与固相支持物上的同源DNA片段杂交。

7. 漂洗：漂洗除去非特异性结合的探针，只留下与同源DNA片段特异性结合的探针。

8. 显影检查：通过显影检查目的DNA所在的位置，确认杂交结果。

请注意，这只是印迹杂交的一个基础流程，具体的操作可能会根据实验目的、所使用的DNA和探针类型以及所使用的仪器设备而有所不同。在进行实验时，应遵循相关的实验室安全规定，并确保所有步骤都按照适当的指南或程序进行。

Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介姜永均󰀁(江苏省如东高级中学󰀁226400)摘󰀁要󰀁Southern印迹杂交(Southernblot)是分子生物学领域中最常用的技术方法之一,该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的,Southern印迹杂交故因此而得名。后来相继出现了三个原理、过程相似,但是操作对象不同的印迹方法,缘于学界前辈的幽默分别将其称为Northernblot、Westernblot和Easternblot,这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。本文简要介绍了Southern印迹杂交及其相关生物技术。关键词󰀁Southern印迹杂交󰀁Northern印迹杂交󰀁Western印迹杂交󰀁Eastern印迹杂交󰀁󰀁在近年的一些省、市中学生生物奥赛试卷中常涉及到Southern印迹、Nouthern印迹、Westem印迹等分子生物学技术。本文将Southern印迹杂交及其相关生物技术作一个简单介绍。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交技术1975年由英国人埃德温󰀁迈勒󰀁萨瑟恩(EdwinMellorSouthern)创建。1977年詹姆斯󰀁艾尔文(JamesAlwine)等把此方法应用到RNA的研究方面,称作Northern印迹法。1979年乔治󰀁斯塔克(GeorgeStark)等则把该方法扩展应用到单向电泳后的蛋白质分子的分析方面,被称作Western印迹法。1982年Reinhart报道双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,称之为Eastern印迹法。目前,有人把Sou󰀁hern、Northern、Westher印迹法分别称作DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法。1󰀁Southern印迹杂交Southernblot又称凝胶电泳压印杂交技术,该方法利用硝酸纤维膜或滤纸或尼龙膜等具有吸附DNA的功能,先将DNA片段作凝胶电泳,并将电泳后的DNA区带吸附到膜上,然后直接在膜上进行同位素标记探针与被测DNA之间的杂交,最后通过放射自显影对杂交结果进行检测,以此探测一个DNA样品中含有的特定DNA序列。Southern印迹杂交基本步骤如下:1.1󰀁待测DNA样品的制备󰀁先以特定方法获取待测DNA,由于基因组DNA很长,需要用DNA限制酶消化,将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析。一般选择一种限制酶来切割DNA分子,但有时为了某些特殊的目的,分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定,有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA后,加入EDTA,65󰀁加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离,必要时可进行乙醇沉淀,浓缩DNA样品后再进行电泳分离。1.2󰀁琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品󰀁在恒定电压下,将DNA样品放在0.8%~1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳,标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70~80000bp的DNA片段,故可对DNA片段进行分离。但需要用不同的胶浓度来分辨这个范围内的不同的DNA片段。原则是分辨大片断的DNA需要用浓度较低的胶,分辨小片段DNA则需要浓度较高的胶。经过一段时间电泳后,DNA按分子大小在凝胶中形成许多条带,大小相同的分子处于同一条带。另外,为了便于测定待测DNA分子量的大小,往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA(DNAmarker)进行电泳。DNAmarker可以用放射性核素进行末端标记,通过这种方式,杂交后的标准分子量DNA也能显影出条带。1.3󰀁电泳凝胶预处理󰀁DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了有效地实现Southern印迹转移,对电泳凝胶做预处理十分必要。分子量超过10kb的较大的DNA片段与较短的小分子量DNA相比,需要更长的转移时间。所以为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来,必须将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。DNA的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。因此,通常是将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L的HCL溶液短暂的脱嘌呤处理之后,移至于碱性溶液中浸泡,使DNA变形并断裂形成较短的单链DNA片段,再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。这样,DNA片段经过碱变性作用,亦会使之保持单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。1.4󰀁转膜󰀁即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿着与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上的,因此,凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂,转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样,故而称为印迹(blotting)。用于转膜的固相支持物有多种,包括硝酸纤维素膜(NC膜)、尼龙(Ny󰀁lon)膜、化学活化膜和滤纸等,转膜时可根据不同需要󰀁64󰀁生物学教学2010年(第35卷)第11期选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是NC膜和和Nylon膜。1.5󰀁探针标记󰀁用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。探针可以用放射性物质32P标记或用地高辛标记,放射性标记灵敏度高、效果好;地高辛标记没有半衰期,安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4多聚核苷酸激酶进行末端标记。探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法。1.6󰀁预杂交󰀁将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前,必须先有一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA,在进行杂交前,必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭,这就是预杂交的目的。预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行,袋中装有预杂交液,使预杂交液不断在膜上流动。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液,可以自制或从公司购买,不同的杂交液配方相差较大,杂交温度也不同。但其中主要含有鲑鱼精子DNA(该DNA与哺乳动物的同源性极低,不会与DNA探针DNA杂交)、牛血清等,这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。1.7󰀁Southern杂交󰀁转印后的滤膜在预杂交液中温育4~6h,即可加入标记的探针DNA(探针DNA预先经加热变性成为单链DNA分子),即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜,然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低,温度越高,杂交的严格程度越高。也就是说,只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时,才能在低盐高温的杂交条件下结合。1.8󰀁洗膜󰀁取出NC膜,在2󰀁SSC溶液中漂洗5min,然后按照特定要求洗膜。洗膜是采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交需注意的关键一步。在洗膜过程中,要不断振荡,不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。当放射强度指示数值较环境背景高1~2倍时,即停止洗膜。洗完的膜浸入2󰀁SSC中2min,取出膜,用滤纸吸干膜表面的水分,并用保鲜膜包裹。注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。1.9󰀁放射性自显影检测󰀁先将滤膜正面向上,放入暗盒中(加双侧增感屏),而后在暗室内,将2张X光底片放入曝光暗盒,并用透明胶带固定,合上暗盒。再将暗盒置-70󰀁低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光(根据信号强弱决定曝光时间)。一般在1~3d后从冰箱中取出暗盒,置室温1~2h,使其温度上升至室温,然后冲洗X光底片,并分析检测。2󰀁其他印迹杂交技术2.1󰀁Northern印迹杂交󰀁Northernblot被用于研究特定类别的RNA分子的表达模式(丰度和大小),是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂交。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似,只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性,而不用NaOH,因为它会水解RNA的2󰀁-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合,它同样可在高盐中进行转印,但在烘烤前与膜结合得并不牢固,所以在转印后用低盐缓冲液洗脱,否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB,因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小,可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳,之后将标记物切下、上色、照相,样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5ug/mLEB的0.1mol/L醋酸铵中10min,光在水中就可脱色,在紫外光下用一次成像相机拍照时,上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光。若接触太多或在白炽灯下暴露过久,会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时,甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂,但有毒,因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。2.2󰀁Western印迹杂交󰀁Westernblot中文一般称为蛋白质印迹。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。Westernblot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似,但Westernblot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,󰀁探针󰀁是抗体,󰀁显色󰀁用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜NC膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。2.3󰀁Eastern印迹杂交󰀁Easternblot是Westernblot的变形,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为East󰀁ern印迹法。所谓的双向电泳是先用等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-PAGE)分离蛋白质,然后也是将蛋白质的分离区带,以电驱动转移方式进行了印迹。󰀁󰀁65󰀁生物学教学2010年(第35卷)第11期

个人自主学习研究报告

本次研讨方向：70~80年代分子生物学与基因工程在技术上的突破

本人承担的具体学习研讨主题：核酸印迹技术与分子杂交

印迹技术是指将待测核酸分子结合到一定固相支持物上的方法。主要分类有两种：southern印迹，western印迹也称Western免疫印迹。

Southern印迹是将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。其过程是DNA分子被限制酶切，经琼脂糖凝胶电泳，将DNA片段按照分子量大小分离，然后将含DNA片段的琼脂糖凝胶变性，将其中单链DNA转移到硝酸纤维滤膜或者其他固相支持物上。而DNA片段的相对位置保持不变。可用来下一步杂交反应；western印迹也称Western免疫印迹（Western Blot或Western Blotting），是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白，分析基因的表达程度。能用碱变性，防止水解。用甲醛变性。

分子杂交技术是用不同的DNA不同的DNA 片段之间，DNA 片段与RNA

片段之间，如果彼此间的核苷酸排列顺序互补也可以复性，形成新的双螺旋结构。像这样按照互补碱基配对原则而使不完全互补的两条多核苷酸相互结合的过程称为分子杂交。分子杂交的方式有固相杂交、液相杂交、菌落原位杂交、斑点杂交、southern印迹杂、northern印迹杂交、组织原位杂交

核酸印迹技术和分子杂交自70年以来发展特别迅猛1971年，限制性核酸内切酶被发现，紧接着伯格在实验室中构筑了第一个重组的DNA分子，这意味着生物体的遗传性状可以人为地改造。1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具； 1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功,转化大肠杆菌,使本来在真核细胞中合成的蛋白质能在细菌中合成,打破了种属界限。渐渐地核酸印迹技术与分子杂交在基因诊断与基因治疗特别是医学领域发展起到了重要作用.