放线菌新种分类鉴定

细菌分类鉴定规程细菌分类鉴定规程杜艳、余翔、罗国升新菌鉴定主要流程：1、潜在新菌的确定拿到拼接好的16Sr RNA gene序列后，进入NCBI blastN ()或EzTaxon server 2.1() 进行比较，同源性低于98%的序列(同源性处于98-97%之间的序列最好少于3株)，可初步判断存在新菌的可能。

2、选择标准菌株构建进化树选择参考菌株构建三种进化树(NJ、MP和ML)，构建进化树是需要注意以下几点：1）所选择的序列必须都是在IJSEM上正式发表的序列，2）所选择的参考菌株必须包含新菌所在属的所有标准菌株，3）需要选择新菌所在科的一些与新种所在属相近的属的type species作为参考菌株，4）需要选择一个远源的菌株作为参考菌株，如：E. coli。

3、购买标准菌株根据进化树位置和同源性高低选择标准菌株作为参考菌株，联系相关保藏机构购买标准菌株。

具体信息可以在上查找。

标准菌株的选择需遵循以下几点：1) 如果要用到不同的属但不是用这些属的所有的种，则要选择这些属的模式种，并且要选择模式种的模式菌株。

2) 一个属的模式种是最重要的参照微生物，如果一个新种被认为属于这个属，就一定要与该属的模式种进行比较，而其他的种可能分类时出现错误，可能将来会被重新分类。

总之，进行种、属、甚至是科的比较研究时，都要用模式微生物，这就涉及到模式属的模式种，模式种的模式菌。

4、表型特征实验培养特征：菌落特征(如菌落的形状、大小、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽、水溶性色素等)。

细胞形态：形态(球形、杆状、弧形、螺旋形、丝状、分枝及特殊形状)，大小，排列(单个、成对、成链或其他特殊排列方式)。

特殊的细胞结构：鞭毛(着生位置、数量)，芽胞(形状、着生位置、是否膨大)，孢子(孢子形状、着生位置、数量、排列)，其它 (荚膜、细胞附属物为柄、丝状物、鞘、蓝细菌的异形胞、静止细胞和连鞘体等)。

超微结构：细胞壁、细胞内膜系统、放线菌抱子表面特征等。

2006～2018年稀有放线菌中的新天然产物放线菌是一类十分重要的植物病原微生物，它们可以对植物产生重大的伤害，也是研究药物、农药、肥料和植物病理学的重要材料。

近年来，有越来越多的证据表明，放线菌也可以产生有益的物质，例如抗微生物活性物质和天然产物。

有研究表明，近几年来以放线菌为目标，科学家们在2006-2018年之间发现了许多新的天然产物。

2006年，一种名为细胞孔类天然产物（Cyclomarins）的新类别被发现，该天然产物来自植物寄生放线菌Epiphyas postvittana，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等活性。

2007年，放线菌Xamphomonas axonopodis pv.citri被用于合成一种名为Axonopsin的新型天然产物，具有抗菌、抗葡萄球菌、抗真菌和抗病毒的活性，同时具有可溶性抗氧化特性。

此外，2008年，来自放线菌Xynthomonas campestris pv. campestris的一种叫做Xacamide的新型天然产物被发现，它具有抗菌、抗真菌、抗病毒和抗细菌性质，而且还可以抑制RNA聚合酶。

另外，一种名为Pantocinisin的特殊天然产物也于2009年被发现，它来自放线菌Pantoea ananatis，能够抑制真菌病原体的生长，其特殊的抗真菌活性被证实为与其结构有关。

2010年，一种名为尼米多稀释亚硫酸酯的新类别天然产物被发现，它来自放线菌Xanthomonas axonopodis pv. citri和放线菌Xanthomonas campestris pv. campestris，具有抑菌、抑真菌和抗病毒的活性。

2012年，一种名为糖苷衍生物的新类别天然产物被发现，来自放线菌Pseudomonas aeruginosa，具有显著的抗菌活性，能有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。

2014年，一种名为Actinomycin D的新类别天然产物被发现，来自放线菌Streptomyces varsoviensis，具有抗病毒、抗真菌性和免疫调节活性，可以抑制常见的病毒和真菌，如腺病毒、柯萨奇病毒、肺炎病毒和变形霉菌等。

海洋放线菌的分类鉴定一、放线菌㈠、放线菌的分布放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界。

不论数量和种类，以土壤中最多。

河流和湖泊中，放线菌数量不多，大多为小单孢菌、游动放线菌和孢囊链霉菌，还有少数链霉菌。

海洋中的放线菌多半来自土壤或生存在漂浮海面的藻体上。

海水中还存在耐盐放线菌。

放线菌有一种土霉味，使水和食物变味，有的放线菌也能和霉菌一样使棉毛制品或纸张霉变。

放线菌主要能促使土壤中的动物和植物遗骸腐烂，最主要的致病放线菌是结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，可导致人类的结核病和麻风病。

放线菌最重要的作用是可以产生、提炼抗生素，目前世界上已经发现的2000多中抗生素中，大约有56%是由放线菌（主要是放线菌属）产生的，如链霉素、土霉素、四环素、庆大霉素等都是由放线菌产生的。

此外有些植物用的农用抗生素和维生素等也是由放线菌中提炼的。

㈡、放线菌的形态与结构放线菌菌体为单细胞，大多由分枝发达的菌丝组成，最简单的为杆状或具原始菌丝。

放线菌是一种革兰氏阳性菌。

放线菌菌丝细胞的结构与细菌基本相同。

根据菌丝形态和功能可分为营养菌丝、气生丝和孢子丝三种。

⑴营养菌丝匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物，故亦称基内菌丝。

营养菌丝一般无隔膜；直径0.2-0.8微米，但长度差别很大，短的小于100微米，长的可达600微米以上；有的无色素，有的产生黄、橙、红、紫、蓝、绿、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，还可透入培养基内，将培养基染上相应的颜色，如果是非水溶性色素，则使菌落吨呈现相应的颜色。

色素是鉴定菌种的重要依据。

⑵气生菌丝长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。

它叠生于营养菌丝上，以至可覆盖整个菌落表面。

在光学显微镜下，颜色较深，直径比营养菌丝粗，约1-1.4微米，其长度则更悬殊。

直形或弯曲而分枝，有的产生色素。

⑶孢子丝气生菌丝上分化出可形成孢子的菌丝即孢子丝。

孢子丝的形状和在气生菌丝上的排列方式，随菌种而异。

孢子丝的形状有直形、波曲和螺旋形。

D3-2(93.73%) HZH-2(95.22%)一、16SrRNA基因是细菌系统分类学研究中最常用于分析的基因，它存在于所有的原核生物中，含量大，分子大小适中(约 1.SKb左右)，其基因序列中既含保守序列又含可变序列,便于进行进化距离的分析研究。

一般来说，试验菌株与已知菌的16SrRNA基因序列相似性在95%以下，可以定为新属;相似性在98%以下，可以定为新种，可见16SrRNA基因序列分析的在放线菌系统分类中的重要性，但同时它也并不是唯一指标，尤其是在区分关系较近的不同种时，其作用十分有限，16SrRNA基因相似性在98.5%~99%，仍有50%可能是新种(表1-6)。

近年来，有学者提出，当16SrRNA序列分析的结果不理想时，可改用包含更多的系统发育信息的23SrRNA基因序列代替16SrRNA基因序列;此外，人们发现一些基因转录间隔序列(ITS)，如进化速率比16SrRNA大十多倍16S- 23SrRNA间隔区基因序列，能够弥补16SrRNA基因保守性强，分化程度不够的缺点，可用于种以下分类单元的分类研究(Yoon，1998)。

表1一16SrRNA基因序列相似性与新物种的可能性(徐丽华等，2007)Tablel 16SrDNAsequeneesimilarityandthePossibilityofnewsPeeies16SrDNA序列相似性(%) 可能是新种的比例(%)99 20~3098.5~99 5098~98.5 70~8097~98 9095-97 100新种95 100新属二、每一种生物的DNA均有特定的(G十C)mol%，而且含量稳定，不受菌龄、外界环境的影响，所以在微生物分类鉴定中有着较大的应用价值。

通常认为:种内菌株间相差不超过4%，属内菌株间相差不超过10%，相差低于2%没有分类学意义(Stackebrandi。

ral.，1997)。

(G+C)mol%含量测定主要作用在于否定，即(G+C)mol%含量不同的菌株，肯定不是同一个种，但(G+C)mol%含量相同的放线菌也不一定就是相同或相似的放线菌。

2012届本科毕业论文（设计）放线菌的分类方法姓名: __ __ __________系别:__ 生命科学学院_____专业：___ 生物工程_________学号：_ _ _指导教师：____ ____ ____2012年5 月9日目录摘要 (1)1 放线菌的分类研究意义与方法 (2)1.1放线菌 (2)2放线菌的分类方法的发展历程与意义 (3)2.1形态学与培养特征上的分类与鉴定 (3)2.2数值分类方法 (3)2.3化学分类 (3)3 放线菌的分子生物学分类的发展情况 (4)3.1.DNA碱基组成分析： (4)3.2.DNA-DNA同源性分析： (4)3.3.DNA-rRNA同源性分析： (4)3.4.核酸的一级结构的分析： (5)3.5.16S rRNA基因序列分析： (5)3.7.PCR-RFLP分析： (5)3.8.rep-PCR指纹分析技术： (5)3.9.RAPD分析： (6)3.10.AFLP指纹分析技术： (6)4放线菌的分类在未来发展的方向及意义 (6)参考文献 (6)致谢................................................................ 错误!未定义书签。

放线菌的分类方法摘要：放线菌是原核生物的一个类群，相关分类学经历了早期的形态学上的经典分类（主要从其形态结构来进行分类），数值分类（运用计算科学与技术对放线菌进行描述分类），化学分类（运用化学分析的方法对放线菌的细胞壁和组成成分进行分析归类），直至今天的分子分类。

通过对放线菌的分类进而建成系统进化树，更加方便了放线菌的研究与应用。

由于科学进步的发展放线菌在分子分类中又有了不同的研究方法，由（G+C）mol%的差别而分析的物种亲缘关系的远近形成的DNA碱基组成分析发展到在DNA杂交中的DNA序列互补程度来推断它们的的DNA-DNA同源性分析，从核酸的一级结构上的分析到RNA的二级结构上的分析等方法。

项目一微生物形态结构观察放线菌（Actinomycetes）是丝状原核微生物，因菌丝是放射性生长而得名。

它是介于细菌和真菌之间的单细胞微生物，其细胞结构和化学成分与细菌相似，属于原核微生物；而其菌体呈丝状，有分支，以孢子繁殖，这些特征与霉菌相似。

至今已发现的80余属放线菌几乎都呈革兰氏染色阳性。

放线菌与人类的关系极为密切，绝大多数属有益菌，放线菌的产品多种多样，特别突出的是产抗生素，至今已报道通过的近万种抗菌素中，约70%由放线菌产生。

放线菌还是许多酶、维生素等的产生菌。

此外，放线菌在甾体转化、石油脱蜡和污水处理中也有重要应用。

一、放线菌的形态1、放线菌的菌丝链霉菌菌体细胞为单细胞，大多由分枝状菌丝(mycelium)组成，菌丝直径很细，与细菌相似，一般在0.5~1.0µm。

放线菌为原核生物，细胞核无核膜，细胞壁内含胞壁酸和二氨基庚二酸，在营养生长阶段，菌丝内无隔膜，故一般呈多核的单细胞状态。

放线菌的菌丝分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。

（1）基内菌丝(Substrate mycelium)当放线菌孢子落在固体培养基表面并发芽后，就不断伸长、分枝并以放射状向培养基表面和内层扩展，形成大量具有吸收营养和排泄代谢废物功能的基内菌丝，又叫营养菌丝或一级菌丝。

（2）气生菌丝(Aerial mycelium)营养菌丝体发育到一定阶段，向空间方向分化出颜色较深、直径较粗的分枝菌丝，称为气生菌丝，又称二级菌丝。

（3）孢子丝(Reproductive mycelium)放线菌生长到一定阶段，在成熟的气生菌丝上分化出可形成孢子的菌丝，称为孢子丝，又名产孢丝或繁殖菌丝。

孢子丝长到一定阶段可形成孢子，或称分生孢子，孢子形态多样。

二、放线菌的繁殖多数放线菌借形成各种无性孢子进行繁殖的，无性孢子主要有分生孢子和孢囊孢子。

1、分生孢子(Conidium)2、孢囊孢子3、菌丝片段繁殖二、放线菌的群体特征1、在固体培养基上放线菌的菌落一般为圆型，表面光滑或有皱褶、毛状、绒状、或粉状，光学显微镜下观察，可见菌落周围有辐射状菌丝，菌落较小，类似细菌或略大于细菌，菌落形状随菌种不同而不同。

放线菌的分离和鉴定实验器材：1.土壤材料 5 ---10cm 处土壤，放于采集袋中带回实验室。

2.培养基淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基( w /v)）可溶性淀粉2%，KNO3 0. 1%，NaCL 0. 05%，K2HP04 0. 05%，MgSO4 0. 05%，FeSO4 0. 001%，琼脂2% 3.溶液和试剂（1) 20% 甘油( 2) 0. 1%美蓝 A 液: 美蓝0. 3g ，95% 乙醇300ml;B 液: 0. 01% KOH 100ml 混合A 和B 液即成革兰氏染液3( 1) 结晶紫染色液: 甲液结晶紫2g，95% 乙醇20ml;乙液草酸铵0. 8g，蒸馏水80ml。

甲乙液先分别溶解，然后混合在一起，过滤除去残渣后装入滴瓶中备用。

( 2) 碘液: 碘1g，碘化钾2 个，蒸馏水100ml 先取少量蒸馏水加入碘和碘化钾，使碘完全溶解后再加入全部蒸馏水，分装于滴瓶中备用。

( 3) 复红酒精溶液: 碱性复红0. 4g，95%乙醇100ml，溶解装入滴瓶备用。

4.仪器和其他用品无菌纸、带玻璃珠的三角烧瓶、1ml无菌吸管、无菌试管、无菌培养皿一.目的要求：1. 掌握倒平板的方法和常用分离纯化微生物的基本操作。

2. 初步观察土壤中放线菌菌落形态。

3. 初步了解掌握微生物分类的基本方法。

二.实验原理：放线菌在自然界中主要生存于陆地和淡水中，土壤为这类微生物的主要习居场所，无论在种类和数量上都比其他地方繁多。

在中性或偏碱性的土壤和有机质等丰富的土壤中较多。

放线菌以孢子和菌丝片段的形式存在于土壤，每克土壤内含有数万、数十万的孢子。

放线菌的生活史和形态特征放线菌的孢子和孢囊孢子在适宜的环境下吸收水分，膨胀萌发，生出芽管1 －3 个，芽管伸长长出分枝，分枝越来越多，形态菌丝体。

因其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。

基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。

放线菌纲(Actinobacteria)一、酸微菌亚纲(Acidimicrobidae)1 酸微菌目(Acidimicrobiales)酸微菌亚目(Acidimicrobineae)酸微菌科(Acidimicrobiaceae)酸微菌属(Acidimicrobium)典型种：氧化亚铁微酸菌（Acdimicrobium ferrooxidans ）二、红色杆菌亚纲(Rubrobacteridae)1 红色杆菌目(Rubrobacterales)红色杆菌亚目(Rubrobacterineae)红色杆菌科(Rubrobacteraceae)红色杆菌属(Rubrobacter )2 土壤红杆菌目（Solirubrobacterales ）土壤红杆菌科（Solirubrobacteraceae ）扩展杆菌科（Patulibacteraceae ）康奈斯氏杆菌科（Conexibacteraceae ）康奈斯氏杆菌属(Conexibacter )3 嗜热油菌目（Thermoleophilales ）嗜热油菌科（Thermoleophilacceae ）嗜热油菌属（Thermoleophilum ）三、红蝽杆菌亚纲（Coriobacteride ）1 红蝽杆菌目（Coriobacteriales ）红蝽杆菌科（Coriobacteriaceae ）红蝽杆菌属（Coriobacterium ）阿托波菌属（Atopobium ）扣林氏菌属 （Collinsella ）神秘杆菌属(Cryptobacterium )1酸微菌亚纲(Acidimicrobidae) 2红色杆菌亚纲(Rubrobacteridae) 3红蝽杆菌亚纲（Coriobacteride ） 4 腈基降解菌亚纲（Nitriliruptoride ）5放线菌亚纲(Actinobacteridae)反硝化杆菌属(Denitrobacterium)伊格尔兹氏菌属(Eggerthella)欧陆森氏菌属(Olsenella)斯莱克氏菌属(Slackia)非消化糖杆菌属(Asccharobacter）肠杆菌属（Enterorhabdus）戈登氏杆菌属（Gordonibacter）类伊格尔兹氏菌属（Paraeggerthella）四、腈基降解菌亚纲（Nitriliruptoride）1 腈基降解菌目（Nitriliruptorales）腈基降解菌科（Nitriliruptoraceae）腈基降解菌属（Nitriliruptor）2尤泽比氏菌目（Euzebyales）尤泽比氏菌科（Euzebyaceae）尤泽比氏菌属（Euzebya）五、放线菌亚纲(Actinobacteridae)1 放线菌目(Actinobacterales)放线菌亚目(Actinomycineae)放线菌科(Actinomycetaceae)放线菌属(Actinomyces)放线杆菌属(Actinobaculum)隐秘杆菌属(Arcanobacterium)动弯杆菌属(Mobiluncus)弯曲短杆菌属(Varibaculum)链霉菌亚目(Streptomycineae)链霉菌科(Sterptomycetaceae)链霉菌属(Streptomyces)北里孢菌属(Kitasatospora)链嗜酸菌属（Streptacidiphilus）链孢囊菌亚目(Streptosporangineae)链孢囊菌科(Streptosporangiaceae)链孢囊菌属(Streptosporangium)小双孢菌属（Microbispora）小四孢菌属(Microtetraspora)野野村氏菌属(Nonomuraea)游动单孢菌属(Planomonospora)。

放线菌筛选的一般方法放线菌筛选是一种从大自然中寻找新的抗生素和其他有用化合物的方法。

放线菌是一类革兰氏阳性细菌，与其他细菌存在显著区别，它们具有许多生物活性代谢产物的天然合成能力。

因此，放线菌筛选被广泛应用于寻找新的抗生素和其他有活性的化合物。

1.采集样本：首先，需要在大自然环境中采集到放线菌的样本。

放线菌广泛分布于土壤、水体、植物等各种环境中，因此可以从这些环境中采集到样本用于筛选。

样本的采集可以通过在目标环境中收集土壤或其他样品，并将其置于合适的容器中保存。

2.预处理：采集到的样本通常含有大量不同种类的微生物，因此需要进行预处理步骤。

预处理的目的是去除其他微生物，只留下放线菌。

常用的预处理方法包括加热处理、酸碱处理、稀释等。

3. 筛选培养基的选择：放线菌的生长需要适宜的培养基，因此在筛选之前需要选择合适的培养基。

常用的培养基包括Mannitol-Soya agar （MSA）、Glycerol Yale agar（GYA）、Starch Casitone-Nitrate agar （SCN）等。

4.筛选培养条件的优化：放线菌的生长条件可以通过培养条件的优化来改善。

常用的优化参数包括温度、pH、培养时间和培养基成分等。

优化培养条件可以提高放线菌生长的速度和产生生物活性物质的能力。

5.放线菌分离：在筛选培养基上，可以观察到放线菌的集落。

这些集落可以单独分离，得到纯种的放线菌菌株。

分离放线菌的常用方法包括传代分离和扩散板法等。

6.放线菌菌株的筛选：得到纯种的放线菌菌株后，可以进行生物活性物质的筛选。

常用的筛选方法包括抗菌活性测定、抗肿瘤活性测定和酶活性测定等。

这些方法可以通过测量抑菌圈直径、细胞生存率和酶催化能力来评估放线菌菌株的活性。

7.活性物质的提取和纯化：经过筛选得到有活性的放线菌菌株后，还需要将其产生的活性物质进行提取和纯化。

常用的提取方法包括溶剂提取法、胶体微滤法和萃取法等。

而纯化方法则包括柱层析、薄层层析和高效液相层析等。