乳酸菌的分离与纯化实验报告

发酵工程学实验报告

实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作

学 院

生命科学学院

专 业 应用生物教育

班 级 12应生A班

姓 名 李顺昌

学 号 124120218

实验课程 乳酸菌的分离和酸奶的制作

指导教师 许 波

开课学期 2014—2015学年下学期

实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作

小组合作：是 小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤

一、实验目的

1.掌握分离纯化微生物的基本方法

2.掌握酸奶制作的基本原理

3.学会酸奶的制作方法

二、实验设备与材料

1、仪器设备：三角瓶、平皿、试管、移液管、玻璃涂布棒、灭菌锅、超净工作台、培养箱、恒温摇床、冰箱等。

2、材料：市售酸奶、奶粉、白糖、棉花、酸奶瓶（自备，1个/人）等。

3、培养基：乳酸菌分离用

乳酸菌分离用培养基：牛肉膏：0.5％；酵母膏：0.5％； 蛋白胨：1％；葡萄糖：1％；乳糖：0.5％；NaCl：0.5％；琼脂：2.5％；pH6.8。

配制250mL/组，装于2个三角瓶

三、实验原理

1、酸奶制作的基本原理

（1）酸奶：以牛奶为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种乳制品饮料。

（2）生理生化原理

牛奶（乳糖）→接种乳酸菌→β-D-半乳糖苷酶→乳糖（半乳糖和葡萄糖）→乳酸发酵（葡萄糖）→乳酸→破坏钙-酪蛋白-磷酸复合物的稳定性→蛋白质凝结→酸奶

2、提供适宜的生长条件、采用一定的微生物分离纯化方法，就能够从酸奶中分离出乳酸菌。

3、酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对人体的肠胃消化道疾病有良好的治疗效果。

四、实验方法步骤 （一）乳酸菌的分离纯化——稀释涂布平板法

1、倒平板（约6块/100ml）

2、制备酸奶稀释液

（1）将0.5mL酸奶吸入4.5mL无菌水（自备）中，摇动5min；

乳酸菌的分别.纯化与判定

第一部分：乳酸菌的分别.纯化

一.实验器材:

新颖乳酸饮料（市售）.脱脂奶粉.蔗糖.1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿.无水乙醇).酵母膏.琼脂.革兰氏染液（结晶紫染液.卢戈氏碘液.95%乙醇.沙黄）.75%乙醇.喷鼻柏油.1mol/L

NaOH.1mol/L HCl.碳酸钙;

0.4gNaOH固体.4.2ml浓HCL(剖析纯) .20gCaCO3固体.酵母膏20g .琼脂30g

喷鼻柏油.脱脂奶粉100g .蔗糖10g;

2.仪器与装备 高压蒸汽灭菌锅.光学显微镜.造就箱.pH试纸.酸乳瓶.造就皿（φ9或φ12）.试管.300ml三角瓶（带玻珠）.移液管.天平.500ml锥形瓶.250ml锥形瓶.250ml烧杯.

二.实验步调：

1.造就基配制（BCG牛乳造就基）：

（A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,参加1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混杂平均后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿参加20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成）

（B）溶液：酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热消融,用周详pH试纸调节pH到6.8,分装入三角瓶后在103kPa

121℃高压蒸汽灭菌20Min. 以无菌操纵趁热将(A)(B)溶液平均混杂.

2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml,1%草酸氨水溶液80ml.将两液混匀,放置24小时后过滤即可.

2.2 卢哥氏碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml.先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后参加碘使之完整消融,再参加蒸馏水300ml即成.

2.3 蕃红溶液：番红2.5g,95%乙醇100ml,消融后存于密闭的棕色瓶中.用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可.

2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g,95%乙醇300ml;B液：0.01% KOH 100ml.混杂A和B液即成,按1：100稀释即可.

乳酸菌实验报告 乳酸菌的分离与培养

保加利亚乳杆菌

组长：王小英

组员：王小英 郑春玲 阙小琴 柳洁

实验目的： 1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；

2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；

3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。

4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。

5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。

6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。

7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。

8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。

实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 实验器材：

蛋白质的表达、分离、纯化实验

蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。

实验方法原理

携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

实验材料：大肠杆菌BL21

试剂、试剂盒：LB液体培养基、 氨苄青霉素、 Washing Buffer Elution Buffer IPTG 、蒸馏水 、胰蛋白胨 、酵母粉、 氯化钠

仪器、耗材：摇床 、离心机、 层析柱、 离心管、 移液枪、 枪头盒 、烧杯 、玻璃棒

实验步骤

一、试剂准备

1. LB液体培养基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。

2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。

3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。

4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。

5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea， 500 mM Imidazole， pH8.0。

6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、获得目的基因

1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。