02-重组赖氨酰内切酶 重组赖氨酰肽链内切酶(Lys C)

蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。

酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。

蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。

本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。

关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点Influencing Factors Analysis of Protease Specific CleavageSitesAbstract:Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low choice of protease and protein source is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production.Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites1.前言生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽，是氨基酸以不同组成和排列方式构成的不同肽类的总称（氨基酸数目一般小于100）。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC ）是全球常见的恶性肿瘤之一，其死亡率每年以2%~3%持续增加[1]。

典型的HCC 进展是一个多步骤、多机制的过程，涉及转化、存活、增殖、侵袭、血管生成和转移。

大部分HCC 诊断时即为晚期，且目前也缺乏有效的治疗措施。

即使部分患者接受了根治性切除术，但由于HCC 易复发、侵袭性强，其远期生存率依然不太理想。

目前HCC 已成为我国第四位常见恶性肿瘤及第二位肿瘤致死病因，严重威胁我国人民的生命及健康[2-4]。

因此HCC 的早期诊断及后续的治疗成为目前所面临的巨大挑战。

肿瘤微环境（tumor microenvironment ，TME ）由肿瘤细胞、基质细胞（包括成纤维细胞）、内皮细胞和免疫细胞、巨噬细胞和淋巴细胞及细胞外基质（extracellular matrix ，ECM ）如胶原蛋白、纤连蛋白、透明质酸、层粘连蛋白等组成[5]，与肿瘤发生、发展有着密切联系。

TME 中的非癌细胞通过刺激和促进不受控制的细胞增殖，在肿瘤的分化、迁移和转移等各个阶段都发挥着关键作用[6]。

研究表明，赖氨酰氧化酶样蛋白2（lysyl oxidase-like 2，LOXL2）是维持微环境稳态的关键蛋白，参与细胞信号调控和转录调节、肿瘤抑制和转移、促进血管生成、上皮细胞-间充质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition ，EMT ）和免疫调节等多种生物学过程，在肝癌细胞和组织中的表达水平增高，并与HCC 患者不良预后相关[7-9]。

本文对LOXL2在HCC 发生、发展中的作用进行综述，以期为HCC 防治的深入研究提供参考。

1 赖氨酰氧化酶样蛋白2的结构及生理功能赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase ，LOX ）家族成员包括5种铜依赖性氨基氧化酶：LOX 和赖氨酰氧化酶样赖氨酰氧化酶样蛋白2在肝细胞癌发生发展中的作用研究进展申亚琼，李皎，李兴欣，徐敬*，金焰（昆明理工大学附属昆华医院/云南省第一人民医院肝胆外科，云南昆明 650032）摘要赖氨酰氧化酶样蛋白2（lysyl oxidase-like 2，LOXL2）是赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）家族成员之一，可催化细胞外基质中胶原蛋白与弹性蛋白共价交联，在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中过表达可促进肝癌细胞生长、肿瘤侵袭及转移。

第八章含氮化合物代谢一、知识要点蛋白质和核酸是生物体中有重要功能的含氮有机化合物，它们共同决定和参与多种多样的生命活动。

在自然界的氮素循环中，大气是氮的主要储库，微生物通过固氮酶的作用将大气中的分子态氮转化成氨，硝酸还原酶和亚硝酸还原酶也可以将硝态氮还原为氨，在生物体中氨通过同化作用和转氨基作用等方式转化成有机氮，进而参与蛋白质和核酸的合成。

（一）蛋白质和氨基酸的酶促降解在蛋白质分解过程中，蛋白质被蛋白酶和肽酶降解成氨基酸。

氨基酸用于合成新的蛋白质或转变成其它含氮化合物（如卟啉、激素等），也有部分氨基酸通过脱氨和脱羧作用产生其它活性物质或为机体提供能量，脱下的氨可被重新利用或经尿素循环转变成尿素排出体外。

（二）氨基酸的生物合成转氨基作用是氨基酸合成的主要方式。

转氨酶以磷酸吡哆醛为辅酶，谷氨酸是主要的氨基供体，氨基酸的碳架主要来自糖代谢的中间物。

不同的氨基酸生物合成途径各不相同，但它们都有一个共同的特征，就是所有氨基酸都不是以CO2和NH3为起始原料从头合成的，而是起始于三羧酸循环、糖酵解途径和磷酸戊糖途径的中间物。

不同生物合成氨基酸的能力不同，植物和大部分微生物能合成全部20种氨基酸，而人和其它哺乳动物及昆虫等只能合成部分氨基酸，机体不能合成的氨基酸称为必须氨基酸，人有八种必需氨基酸，它们是：Lys、Trp、Phe、Val、Thr、Leu、Ile和Met。

（三）核酸的酶促降解核酸通过核酸酶降解成核苷酸，核苷酸在核苷酸酶的作用下可进一步降解为碱基、戊糖和磷酸。

戊糖参与糖代谢，嘌呤碱经脱氨、氧化生成尿酸，尿酸是人类和灵长类动物嘌呤代谢的终产物。

其它哺乳动物可将尿酸进一步氧化生成尿囊酸。

植物体内嘌呤代谢途径与动物相似，但产生的尿囊酸不是被排出体外，而是经运输并贮藏起来，被重新利用。

嘧啶的降解过程比较复杂。

胞嘧啶脱氨后转变成尿嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶经还原、水解、脱氨、脱羧分别产生β-丙氨酸和β-氨基异丁酸，两者经脱氨后转变成相应的酮酸，进入TCA循环进行分解和转化。

蛋白酶的种类1．木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。

是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。

木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。

此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。

木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。

它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。

木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。

是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。

它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。

最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI)为8.75；最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

2．胃蛋白酶胃蛋白酶（英文名称：Pepsin）是一种消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主细胞所分泌，功能是将食物中的蛋白质分解为小的肽片段。

胃蛋白酶原由胃底主细胞分泌，在pH1.5～5.0条件下，被活化成胃蛋白酶，将蛋白质分解为胨，而且一部分被分解为酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。

可分解蛋白质中苯丙氨酸或酪氨酸与其他氨基酸形成的肽键，产物为蛋白胨及少量的多肽和氨基酸，该酶的最适pH为2左右。

3．中性蛋白酶中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。

RP-HPLC-MS方法分析几种蛋白的胰蛋白酶酶解多肽产物的条件优化引言在生物体内，蛋白的翻译后修饰过程是蛋白发挥各种不同生化功能的基础，这些翻译后修饰包括糖基化、氧化、甲基化和磷酸化等。

作为生物药物的蛋白在生产、运输、保存过程中会产生变体，从而影响到药物的活性和稳定性。

因此蛋白的肽谱经常被用来研究蛋白的翻译后修饰过程以及蛋白变体的存在。

同时也用于生物制药行业蛋白产品初级结构的确认 [1-3] ，从而更好地控制生化药品的质量和确保病人的用药安全。

本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物-多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。

仪器配置Thermo Ultimate 3000系统：泵：DGP-3600RS；自动进样器：WPS-3000TRS；柱温箱：TCC-3000RS；检测器：DAD-3000RS 质谱：TSQ Vantage色谱软件：Chromeleon 6.8测试条件与紫外检测器兼容的液相色谱条件色谱柱： 1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/N063691, S/N001119)；2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/N1008512×7, LOT10603)；流动相： 95%超纯水+5%乙腈+0.1%TFA：5%超纯水+95%乙腈+0.08%TFA, 梯度洗脱：Time/min A/%B/%098240406040.1208045208045.198260982流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)分析时间：60 min检测器波长：214 nm进样量：20 µL柱温：35 ℃与质谱兼容的液相色谱条件色谱柱：1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/N063691,S/N001119)；2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/N1008512×7, LOT10603)；流动相：A：2%乙腈, B：98%乙腈, C：10 mmol/L 醋酸铵，用乙酸调节pH=3.75, D：10mmol/L 醋酸铵，用氨水调节pH=9.79,梯度洗脱：Time/min A/%B/%C/D% -5.0782200.0782206030502060.108020650802065.1782207578220张婷婷金燕赛默飞世尔科技（中国）有限公司2流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)分析时间：60 min质谱条件：离子化方式： ESI, Positive Voltage: 3000 V; Capillary Temperature: 350.0 ℃ Vaporizer Temperature: 400.0 ℃Sheath Gas Pressure: 40.0 arb, Ion Sweep GasPressure: 0 arb Auxiliary Gas Pressure: 12.0 arb; Scan Range ：150- 1500 m/z 质谱扫描参数：Scan time 0.286 s 分辨率：Q1Peak Width 0.7 FWHM.进样量：20 µL 柱温：35 ℃样品前处理准备牛血清白蛋白(BSA)、马肌红蛋白、细胞色素C 以及胰蛋白酶(Trypsin)四种蛋白标准品。

SIRT6在心血管疾病中的作用研究进展张晓英;张致英【摘要】心血管疾病以高发病率、高死亡率的特点成为危害人类健康的严重疾病.SIRT6作为组蛋白去乙酰化酶家族的重要成员,在动脉粥样硬化、心肌梗死以及缺血/再灌注损伤、病理性心肌肥大、心力衰竭等心血管疾病中发挥重要作用.该文主要针对SIRT6在心血管疾病中的作用进行综述,并对以SIRT6为靶点的激动剂和抑制剂的研究做一总结.%Cardiovascular disease is a serious disease harmful to human health with high morbidity and high mortality.SIRT6 plays an important role in cardiovascular diseases such asatherosclerosis,myocardial infarction and ischemia/reperfusioninjury,pathological cardiac hypertrophy and heart failure,as an important member of the histone deacetylase family.In this paper,the role of SIRT6 in cardiovascular diseases is reviewed,and the development of SIRT6 as a target agonist and inhibitor is summarized.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2018(034)002【总页数】4页(P170-173)【关键词】SIRT6;去乙酰化;动脉粥样硬化;心肌梗死;心肌肥大;激动剂;抑制剂【作者】张晓英;张致英【作者单位】西藏民族大学医学部基础医学院藏药筛选实验室,陕西咸阳712082;西藏民族大学医学部基础医学院藏药筛选实验室,陕西咸阳712082【正文语种】中文【中图分类】R-05;R341.27;R543.5.;R542.2;R977.3;R977.6世界卫生组织《健康统计报告2016》表明，心血管疾病死亡率居全球非传染性疾病首位，占总死亡率的46%，且有年轻化的趋势[1]。

赖氨酰氧化酶体内外对乳腺癌增殖和侵袭作用的研究杨华伟;刘剑仑;李景涛;韦薇;唐玮;蒋奕【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2013(042)004【摘要】Objective To investigate the effect of lysyl oxidase (LOX) on human breast cancer cell growth, proliferation, invasion and metastasis and to explore its possible role in the mechanism of breast cancer. Methods Lysyl oxidase gene - specific lentiviral RNA interferencevetor(LOX - RNAi - LV ) was designed and synthesized, which was stably transfected into breast cancer cell lines MDA - MB -231. The breast cancer cells were divided into three groups:the experimental group (RNAi) , the negative control group (Mock) and the blank control group ( Con). The changes of cell growth and proliferation of breast cancer cells MDA - MB - 231 were obsered by MTT assay, cell colony formation and Flow cytometric. The cells migration and invasion abilities were measured by cell migration and invasion test(Transwell). 111 cases of human breast cancer tissue and cancer - adjacent breast tissues and 20 cases of benign lesion tissues of LOX, MMP -2 and MMP -9 were detected by immunohistochemistry, and the relationship of LOX between clinicopathological characteristics and MMP -2, MMP -9 was analyzed. Results After transfection 48h, the cell growth inhibition rates of RNAi group was significantly higher than that of the Mock group and the Con group (P = 0. 000). Colony formationexperiments showed that RNAi group cell colony formation rate was significantly lower than the Con group and the Mock group. Transwell results showed that RNAi group through the Transwell chamber filtration membrane cells were 47 ± 2 and 63 ± 2 ,and the difference was significant ( P = 0. 000) . Cell cycle was analyzed by flow cytometry, which showed there was no difference among the three groups. The expression of LOX protein in breast cancer, cancer - adjacent breast tissues and benign breast tumor were 48.64% (54/111) , 26. 13% (29/111) , 20.00% (4/20). The expression of LOX protein in breast cancer was significantly higher than that in cancer - adjacent breast tissues and benign lesion tissues ( P =0.019). The expression of LOX protein was associated with clinical stage, lymph node metastasis, tumor size. Correlation analysis showed that LOX protein expression was significantly positive correlation with MMP -2 (r = 0. 262,P =0. 005) and MMP-9(r =0.424, P = 0.000). Conclusion LOX can promote invasion and metastasis of breast cancer. LOX and MMP - 2, MMP - 9 may have a collaborative role in promoting invasion and metastasis of breast cancer.%目的探讨赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)对人乳腺癌细胞的生长增殖、侵袭及转移能力的影响及可能作用的机制.方法构建LOX基因的特异性慢病毒干扰载体(LOX-RNAi-LV),稳定转染至乳腺癌细胞MDA-MB-231,实验设3个组,即空白组(Con)、干扰组(RNAi)、阴性对照组(Mock),四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、细胞集落形成实验及流式细胞仪观察细胞生长及增殖情况,细胞侵袭迁移实验(Transwell)检测细胞侵袭及迁徙能力改变；免疫组织化学法检测111例人乳腺癌组织、癌旁乳腺组织及20例乳腺良性病变组织中LOX、基质金属蛋白酶(MMP-2,MMP-9)的表达,并对LOX与临床病理资料及MMP-2、MMP-9的相关性进行分析.结果转染72h后,MTT法显示干扰组细胞生长明显受抑制；细胞集落形成实验显示干扰组的细胞集落形成率明显低于空白组和对照组；Transwell侵袭和迁移实验结果显示RNAi组穿过Transwell小室滤过膜细胞数分别为47 +2和63 +2,差异有统计学意义(P=0.000)；流式细胞仪测定细胞周期,3组之间差异无统计学意义.LOX蛋白在人乳腺癌、癌旁乳腺组织及乳腺良性肿瘤组织中的表达率分别为48.64％ (54/111)、26.13％(29/111)、20.00％(4/20),乳腺癌组织中LOX蛋白的表达率明显高于癌旁乳腺组织及乳腺良性肿瘤组织(P =0.019).LOX蛋白在不同肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移的表达率存在显著差异.相关分析显示,LOX蛋白表达与MMP-2(r =0.262,P=0.005)、MMP-9(r =0.424,P=0.000)蛋白之间呈显著正相关.结论 LOX可以促进乳腺癌的侵袭转移；LOX和MMP-2、MMP-9转移因子可能具有协同促进作用,促进了乳腺癌的侵袭转移.【总页数】5页(P73-77)【作者】杨华伟;刘剑仑;李景涛;韦薇;唐玮;蒋奕【作者单位】530021南宁,广西医科大学附属肿瘤医院乳腺中心【正文语种】中文【相关文献】1.N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸对血小板洐生生长因子介导的NIH3T3细胞增殖的抑制调节作用 [J], 杨方;赵丹;马文东;罗玲;户万秘;王丽萍;朱曦玲;孙树勋2.赖氨酰氧化酶与乳腺癌侵袭转移相关因子的研究 [J], 杨华伟;刘剑仑;李景涛;刘起鹏;韦薇;唐玮;蒋奕3.N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸对转化生长因子β1介导的心肌成纤维细胞增殖的抑制作用 [J], 刘丽;杨方;吴芳;王小君;王瑞敏;罗玲;户万秘;马文东;裴鑫;张丽娟4.干扰赖氨酰氧化酶基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长、增殖的影响 [J], 李景涛;刘剑仑;韦薇;杨华伟;蒋奕;唐玮5.赖赖氨酰氧化酶与乳腺癌关系的研究进展 [J], 耿莹;刘剑仑因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。