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锌和维生素E对Ⅰ型糖尿病大鼠心肌Livin表达的影响医学论文发表——创新医学网/作者:张婷张端莲作者单位:(武汉大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系武汉430071)【摘要】目的:探讨锌(Zn)和维生素E(VE)对糖尿病大鼠心肌细胞保护作用的机制。

方法:按体重将大鼠随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只),实验组动物采用腹腔注射链脲左菌素(streptozotocin,STZ),60mg/kg一次注射,制备糖尿病大鼠模型。

将40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn+VE组。

6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学染色,观察各组心肌组织Livin的表达水平, 利用HPIAS 2000图像分析系统测定Livin在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。

结果:正常对照组心肌细胞内Livin呈阳性表达, 糖尿病对照组心肌细胞内Livin呈阴性表达;糖尿病补锌组和糖尿病补VE 组心肌细胞内Livin呈强阳性表达;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞内Livin呈弱阳性表达。

图像分析结果显示:糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间Livin的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05);糖尿病补Zn+VE组与正常组之间Livin的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。

结论:Zn和VE联合使用可对糖尿病大鼠心肌细胞具有重要的保护作用。

【关键词】锌; 维生素E; 糖尿病; 心肌; Livin糖尿病( diabetes mellitus ,DM) 是一类由于胰岛素绝对或相对缺乏或胰岛素生物活性降低,或者以上二者共同引起体内代谢失调及高血糖状态。

临床上主要分为2 型,即1 型糖尿病和Ⅱ型糖尿病[1]。

Ⅰ型糖尿病,或称胰岛素依赖性糖尿病( IDD) 属于自身免疫性疾病。

机体对自身胰腺β细胞进行持续攻击,造成β细胞大量破坏,胰岛素分泌严重匮乏。

Ⅱ型糖尿病的发病是由于机体对胰岛素产生抵抗,同时合并胰岛素分泌的相对不足[2]。

近几年来,糖尿病的发病率持续增长。

截止到1997年,全世界糖尿病患者为12亿4千万,其中97 %属于Ⅱ型糖尿病[3] 。

随着生活方式的改变,经济的发展,以及人口结构变化,到2010 年,全球糠尿病患者将达到22 亿1 千万。

在中国,糖尿病的患病人口为2 000~4 000 万,并在以年发病率75 万人的速度递增。

如何有效控制糖尿病及其并发症是当前世界医学领域关切的课题。

糖尿病性心肌病是糖尿病的慢性并发症之一,是糖尿病发病过程中特异性的心肌受损和心脏功能改变,糖尿病性心肌病的出现可以不伴有缺血性病变、血管病变及高血压等并发症。

目前有关糖尿病性心肌病的确切病因还不清楚,但认为糖尿病性心肌病的发生主要与心肌能量代谢紊乱、Ca2+ 超载、血管动脉硬化、氧化应激、高血压及高血糖导致的心肌细胞凋亡等有关[4]。

细胞凋亡是由多种因子介导的细胞主动死亡的过程,对机体或组织维持内环境的稳定和生物体的生长发育、生命周期、衰老死亡都有着重要的作用。

在凋亡的调节因素中,凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是新发现的一类在结构上具有同源性的细胞凋亡抑制蛋白,它不仅抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的活性使细胞凋亡受阻,同时还调节着细胞分裂、细胞周期及信号传导等多个重要环节,其成员livin是新发现的凋亡抑制基因, 它可以作为一种酶抑制剂通过BIR结构域与激活的Caspases蛋白,如Caspase3、Caspase7等结合,导致Caspases蛋白的失活和降解。

Caspases 蛋白是介导凋亡的主要因素之一,大多数刺激物通过激活Caspases 蛋白的级联反应而引起凋亡[5~7]。

Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其含量的增加势必有利于这些酶活性的提高。

Zn 对细胞保护作用的途径之一,是基于控制过氧化作用。

VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用。

锌和维生素E是抗氧化剂并具有细胞保护作用。

本研究应用免疫组织化学方法观察了锌和维生素E联合应用对高血糖引起的心肌细胞的保护作用,旨在探讨两者对糖尿病大鼠心肌结构的保护作用。

1 材料与方法1.1 材料昆明种SD大鼠50只,雄性,体重180~200g ,武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1w后进行实验。

1.2 方法1.2.1 动物模型建立及分组按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/ L、pH 4.4 的枸橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。

观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。

一周后,采尾静脉血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ L ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性( + + + ~+ + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。

将选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn+VE组。

各组动物均喂饲人工合成饲料,配方:酪蛋白20 % ,玉米淀粉65% ,植物油8% ,纤维素1% ,混合维生素1% ,混合无机盐5%。

混合维生素和无机盐配方参见文献〔5〕,合成饲料控制锌浓度为20mg/kg。

正常对照组和实验组给予去离子水;补Zn 组给予Zn 浓度为20 mg/L的含ZnSO4·7H2O 去离子水;补VE 组每天以50 mg/ kgVE 灌胃;Zn和VE联合补充组在给予Zn浓度为20mg/L的含ZnSO4 ·7H2O 去离子水的同时以50mg/ kgVE灌胃。

实验期间,密切观察动物进食和饮水量变化,每周称两次体重,6周后将各组大鼠处死,切取心室壁肌组织,进行免疫组织化学实验观察。

1.2.2 主要试剂即用型兔抗鼠Livin单克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司);超敏即用型S P通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

1.2.3 免疫组织化学S P法检测Livin相关抗原主要步骤:①组织切片5 μm,常规脱蜡至水,蒸馏水洗;②3%过氧化氢,37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性,PBS洗4×5min;③切片采用微波抗原修复(3档,10 min),PBS洗4×5min;④正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应;⑤一抗37℃孵育1h,PBS洗4×5min;⑥生物素标记的二抗,37℃孵育10 min,PBS洗4×5min;⑦链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min,PBS洗4×5min;⑧DAB显色液显色,自来水冲洗终止反应;⑨苏木精复染,脱水,透明,封片。

用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.4 免疫组织化学结果判断以胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。

阴性对照除细胞核染成蓝色外,胞浆内无棕黄色反应物。

采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对Livin的表达进行定量分析,每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400),测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率。

以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。

1.2.5 统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK q检验,检验水准α为0.05。

2 结果Livin的表达正常对照组心肌细胞胞核和胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒,Livin表达呈阳性, 糖尿病对照组心肌细胞核和胞浆内可见少量的棕黄色颗粒, Livin表达呈阴性;糖尿病补锌组心肌细胞核和胞浆内可见一些棕黄色颗粒, Livin表达呈弱阳性,糖尿病补VE 组结果与糖尿病补锌组相同;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞核和胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒, Livin表达呈阳性。

图像分析结果显示见表。

糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05);糖尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0.05),见表1。

表1 糖尿病补Zn+VE 组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组Livin表达的平均光密度和阳性面积率注:* 正常对照组与糖尿病对照组比较,P<0.05 ;# 糖尿病对照组与糖尿病补Zn+VE组比较,P<0.05。

3 讨论近年来越来越多的证据证明,绝大多数的2 型糖尿病病人,无论胖瘦,都客观地存在着β细胞总数的减少。

β细胞总数至少受以下4个因素来调节: ①β细胞的复制; ②β细胞的体积; ③新的β细胞生成(比如来自于胰腺导管上皮的新生β细胞) ; ④β细胞的凋亡。

每个因素对于维持β细胞总数的作用,都随着生长发育的不同阶段以及不同的代谢负荷而改变,甚至在不同的种族都有所不同(这种差异在不同种的小鼠之间都有所表现)。

高浓度Glucose 使促凋亡和抗凋亡基因表达失衡,继而改变线粒体的稳态、活化caspase 系统,启动不可逆转的凋亡过程[8~10]。

临床上主要分为2 型,即1 型糖尿病和2 型糖尿病,为一类常见病、多发病,发病率有愈来愈高的趋势。

世界各国糖尿病患病率均上升,其中90%为2型糖尿病。

WHO1997年报告,全世界糖尿病患者1.35亿。

近20年来,中国糖尿病患病率从1980年的0.67 %上升至1997年的3.2 % ,上升近5 倍[11]。

在非传染性疾病中,糖尿病死亡率仅次于肿瘤和心血管病而居第三位。

胰岛素治疗使糖尿病急性并发症死亡率下降,但慢性并发症死亡率却因此而上升。

其根本原因在于对2型糖尿病的病因及发病机制的认识尚不清楚。

关于糖尿病的发病原因,1型糖尿病已研究得较为深入,可能与HLA系统、基因突变等有关。

关于2 型糖目前的认识是由遗传因素与环境因素共同作用,经由胰岛素抵抗、β细胞功能减退、临床糖尿病等不同发展阶段。

糖尿病的发病较为复杂,了解还远远不够。

糖尿病患者在无明显微血管病变时也可出现心力衰竭,表明糖尿病患者心肌细胞本身可以发生结构和功能改变,提示有心肌病的可能[12]。