2016 张学勇 作物学报-作物驯化和品种改良所选择的关键基因及其特点

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(9): 1261 1272/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@ DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01261一个新的水稻D1基因等位突变体的遗传鉴定与基因功能分析王翠红马建王帅田鹏岂长燕赵志超王久林王洁程治军张欣郭秀平雷财林*中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081摘要: 株高是影响水稻产量的一个重要性状。

本研究从水稻稻瘟病普感品种丽江新团黑谷(LTH)经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变群体中分离出一个遗传稳定的小粒矮化突变体LTH-m3。

该突变体是赤霉素(GA)和油菜素内酯(BR)相关突变体, 它对外源GA (GA3)不敏感, 对外源BR (eBL)的敏感性较野生型显著降低。

遗传分析、基因克隆和转基因互补实验确认, 该突变体是一个新的d1基因等位突变体, 其D1基因在第6个外显子与内含子接合处发生单碱基突变(G2522 →A2522), 导致第6外显子被选择性剪切及Gα蛋白翻译提前终止, 从而造成LTH-m3小粒矮化突变表型。

进一步的研究表明, 该突变体D1基因突变引起SD1和SLR1等基因表达的显著改变, 因而影响植株细胞内GA和BR反馈调节功能和信号传递。

突变体LTH-m3弥补了LTH植株过高、茎秆软和极易倒伏等缺陷, 可作为LTH的改良系在今后水稻稻瘟病研究中加以利用, 其功能突变基因的鉴定为深入研究水稻Gα蛋白的功能及激素信号途径提供了新的材料。

关键词:水稻; 突变体; 矮秆基因; 基因克隆; 基因功能Genetic Identification of a New D1-allelic Mutant and Analysis of Its Gene Function in RiceWANG Cui-Hong, MA Jian, WANG Shuai, TIAN Peng, QI Chang-Yan, ZHAO Zhi-Chao, WANG Jiu-Lin, WANG Jie, CHENG Zhi-Jun, ZHANG Xin, GUO Xiu-Ping, and LEI Cai-Lin*National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, ChinaAbstract: Plant height is one of important traits for rice yield. One genetically stable rice mutant, LTH-m3, was isolated from the cv. Lijiangxintuanheigu (LTH)-derived mutant population by mutagenesis using ethylmethane sulfonate (EMS). LTH-m3 was involved in the pathways of gibberellic acid (GA) and brassinosteroid (BR), and showed no sensitiveness to exogenous GA (GA3) and significantly reduced sensitiveness to exogenous BR (eBL) compared with the wild type. The genetic analysis, gene cloning and transgenic complementary test confirmed that LTH-m3 was a new d1-allelic mutant with small grain and dwarf phenotypes, and a single base was mutated (G2522→A2522) in the functional dwarf gene D1 at the conjunction site of its sixth exon and intron, which caused excision of the sixth exon in mRNA and premature termination of the D1 encoded Gα protein, resulting in mutated phenotypes in the mutant. The further study showed that the D1 mutation caused obvious expression change of some dwarf genes such as SD1 and SLR1 in the mutant, and could affect the GA and BR pathways in their feedback regulations and signaling trans-ductions in plant cells. The mutant overcome the defects of the universally blast-susceptible cv. LTH, such as too tall plant, soft stem and easy lodging, and could be utilized as an improved substitute of LTH in the future rice blast researches. The mutated D1 gene identified from the LTH-m3 mutant may be useful for further study of Gα functions and signaling pathways of GA and BR. Keywords: Rice; Mutant; Dwarf gene; Gene cloning; Gene function本研究由国家公益性行业(农业)科研专项经费(201203014)和中国农业科学院科技创新团队项目“作物功能基因组”资助。

《植物育种学》（杨存义）绪论一、名词解释1. 作物品种：是人类在一定的生态条件和经济条件下，在产量、抗性、品质等方面都能符合生产发展的需要，根据人类的需要所选育的某种作物遗传特性稳定、性状一致、特性明显的一定群体。

2．优良品种是指在一定地区和耕作栽培条件下符合生产发展要求，并具有较高经济价值的品种。

二、填空题1．每个作物品种一般都有其所适应的地区范围和耕作栽培条件，而且都只在一定历史时期起作用，所以优良品种一般都是具有地区性和时间性。

2．作物品种可分为纯系品种、杂种品种、综合品种、五性系品种。

3. 作物进化决定于3个基本因素：变异、遗传、选择。

三、简答题1．优良品种在发展农艺生产中的作用主要有：1）提高单位面积产量2）改进产品品质3）保持稳产性和产品品质4）扩大作物种质面积5）有利于耕作制度的改良、复种指数的提高、农业机械化的发展及劳动生产率的提高。

2．作物育种学的基本任务是什么？1）研究和掌握作物性状遗传变异规律的基础上，发掘、研究和利用各有关作物资源；2）并根据各地区的育种目标和原有品种基础，采用适当的育种途径和方法，选育适于该地区生产发展的高产、稳产、优质、抗（耐）病虫害及环境胁迫、生育期适当、适应性较广的优良品种或杂种以及新作物；3）在其繁殖、推广过程中，保持和提高其种性，提供数量多、质量好、成本低的生产用种，促进高产、优质、高效农业的发展。

3．作物育种学的主要内容：1）育种目标的制订及实现目标的相应策略；2）种质资源的搜集、保存、研究评价、利用及创新；3）选择的理论与方法；4）人工创造变异的途径、方法和技术；5）杂种优势利用的途径和方法；6）目标性状的遗传、鉴定及选育方法；7）作物育种各阶段的田间实验技术；8）新品种的审定、推广和种子生产。

4．现代作物育种的发展动向主要表现在以下几方面：1）育种目标要求要高。

现代农业对新品种不仅要求进一步提高单产潜力，增强对多种病虫害及环境胁迫的抗耐性，广泛的适应性；而且还要求具有优良的产品品质和适应机械操作的特性等。

农杆菌介导禾本科牧草遗传转化的研究进展作者：张月李莹戴绍军来源：《上海师范大学学报·自然科学版》2021年第01期摘要：建立禾本科牧草的遗传转化体系对于种质资源利用具有重要意义.近年来，假俭草（Eremochloa ophiuroides）、黑麦草（Lolium perenne）、结缕草（Zoysia japonica）、柳枝稷（Panicum virgatum）、高羊茅（Festuca elata）、二穗短柄草（Brachypodium distachyum）、匍匐剪股颖（Agrostis stolonifera）、朝鲜碱茅（Puccinellia chinampoensis）、羊草（Leymus chinensis）、金发草（Pogonatherum paniceum）、双花草（Dichanthium annulatum）等多种禾本科牧草遗传转化的转化方法不断得到优化与完善.该文总结了近年来禾本科牧草在遗传转化体系优化的研究进展，探讨了植物受体材料、转化条件、共培养时间、乙酰丁香酮浓度、抑菌剂浓度、筛选剂选择压等因素对转化效率的影响.关键词：禾本科牧草; 遗传转化; 影响因素中图分类号： Q 939.9 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2021）01-0021-07Abstract： The establishment of a genetic transformation system for gramineous forages is of great significance to the utilization of germplasm resources.In recent years，the genetic transformation methods of various gramineous forages such as Eremochloa ophiuroides，Lolium perenne，Zoysia japonica，Panicum virgatum，Festuca elata，Brachypodium distachyum，Agrostis stolonifera，Puccinellia chinampoensis，Leymus chinensis，Pogonatherum paniceum and Dichanthium annulatum have been continuously optimized.This article summarized the recent research progress in the optimization of the genetic transformation systems of gramineous forages，and discussed the effects of plant receptor material，transformation condition，co-cultivation time，acetosyringone concentration，bacteriostatic agent concentration，selection pressure of screening agents and other factors on the transformation efficiency.Key words： gramineous forage; genetic transformation; effect factors0 引言利用植物转基因技术将目的基因导入植物基因组是改良植物性状的重要方法之一.建立稳定高效的植物遗传转化体系是获得转基因植株的前提.ZAMBRYSKI等[1]以根癌农杆菌Ti质粒为转化载体，将T-DNA上的基因转入烟草细胞，成功获得了第一株转基因烟草（Nicotiana tabacum L.），此后植物遗传转化技术得到迅速发展.植物遗传转化的方法主要包括农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、细胞融合剂介导（PEG）法、电转化法等.与其他方法相比，农杆菌转化法具有易操作、费用低、转化效率高、基因拷贝数低、可转移较大的DNA片段（50 kb）等优点，逐渐成为植物遗传转化最常用的方法.农杆菌介导的转化系统是一种天然的基因转化系统[2]，农杆菌Ti质粒上的T-DNA可通过植物材料上的伤口进入植物体内并整合到基因组上，经植物有性生殖过程稳定遗传给后代.由于包括禾本科植物在内的单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，利用农杆菌介导法对其进行遗传转化的研究受到限制[3].HIEI等[4]构建了VlrG和VxB高效表达的超双元载体，通过借助酚类化合物乙酰丁香酮诱导成功建立了水稻（Oryza sativa）遗传转化体系，推动了农杆菌介导单子叶遗传转化的研究进程.通过对转化机理的深入探索，以及对转化方法的不断改进、优化与完善，农杆菌转化法已成为介导禾本科作物的常用手段.近年来，利用农杆菌转化法建立了禾本科重要粮食作物水稻[5]、玉米（Zea mays）[6]、小麦（Triticum spp.）[7]、大麦（Hordeum vulgare）[8]、高粱（Sorghum bicolor）[9]，以及主要糖類作物甘蔗（Saccharum officinarum）[10]等的遗传转化系统，并获得了具有各种优良性状的转基因植物.禾本科植物遗传转化体系的建立为研究植物基因功能、植物发育与逆境应答分子调控机制，以及开展分子设计育种提供了理论依据和技术支撑.禾本科牧草具有耐践踏、再生能力强的特点，可作为生物燃料、能源作物，以及牲畜的能量饲料和绿化植物.此外，禾本科牧草在草原生态系统中具有水土保持、防风固沙的作用.近年来，随着生物技术的不断发展，国内外转基因牧草研究也取得了明显进展.利用农杆菌介导法建立了禾本科牧草黑麦草[11]、结缕草[12]、柳枝稷[13]、高羊茅[14]、二穗短柄草[15]、匍匐剪股颖[16]等遗传转化体系，获得了具有优良性状的转基因牧草，在牧草改良方面得到了广泛应用.植物受体材料、转化条件、共培养时间、乙酰丁香酮浓度、抑菌剂浓度、筛选剂选择压等因素对农杆菌介导遗传转化都有一定影响.本文作者将系统介绍各因素对农杆菌介导的禾本科植物遗传转化体系的影响.1 植物受体的选择植物受体的选择是影响农杆菌转化的一个重要因素.分裂时期细胞具有分生能力强、生长旺盛的特点，选择分裂时期的组织器官或细胞作为转化受体可获得较高的转化效率，转化后植株的再生能力较强.农杆菌转化过程中，常用的受体材料包括胚性愈伤组织、幼胚、成熟胚、胚芽、茎尖、叶片等.对于不同植物，随最适外植体的选择不同，转化效率也存在明显差异.在假俭草遗传转化体系中，以种质“E126”的侧芽诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，经农杆菌转化后获得了3.6%的转化率[17];农杆菌介导的黑麦草遗传转化过程中，将成熟胚诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，获得了4.8%的转化效率[18];柳枝稷遗传转化过程中，利用Alamo品种成熟种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，转化效率为6%[19];利用匍匐剪股颖种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，转化效率高达40%，这暗示着利用胚性愈伤组织作为受体材料的遗传转化转化效率最高[16].此外，茎段具有直接生成不定芽的能力，选择结缕草直接茎段作为受体材料可以获得6.8%的转化效率[20].由此可见，对于禾本科植物而言，选择分裂能力旺盛、细胞活性高、DNA合成能力强的胚性细胞作为受体材料，更有利于农杆菌与T-DNA整合，从而提高转化效率.2 转化条件及共培养时间农杆菌介导的遗传转化体系中受体材料的转化条件与共培养时间对转化效率有明显影响.侵染方法不恰当会使农杆菌转化效率降低，侵染时间过短会使农杆菌不能充分依附到受体材料上，导致T-DNA整合效率低，侵染时间过长则容易导致农杆菌过度繁殖，抑菌难度增加，甚至导致受体材料会因农杆菌毒害而死亡.共培养时间影响农杆菌吸附和T-DNA转移[21].农杆菌必须附着在创伤部位16 h以上才能完成转移过程[22].不同作物的最优转化条件与共培养时间存在差异，同一作物不同受体材料的最优转化条件与共培养时间也不同.摸索合适的转化条件与共培养时间是建立高效转化系统所必须的（表1）.可利用冷处理、搅拌孵育和真空处理等手段提高转化效率.在朝鲜碱茅遗传转化体系建立过程中，使用含有二元载体pBI 121的根癌农杆菌菌株EHA105进行转化，当菌液在600 nm 波长处的吸光度值（OD600）达到0.8～1.0时，对成熟种子诱导的胚性愈伤组织浸泡孵育30 min可以达到最佳转化效果[23];对柳枝稷胚性愈伤组织进行遗传转化时，使用含二元载体pCAMBIA 1305.1的根癌农杆菌菌株EHA105，将冷处理20 min后的胚性愈伤组织浸入OD600值为0.5的农杆菌菌液中，经过真空孵育10 min，搅拌孵育20 min，共培养3 d后，其转化效率最高为72.8%[24].这表明：在农杆菌转化前对愈伤组织进行冷处理，可大幅度减少农杆菌侵染后愈伤组织的褐变[25];而转化过程中对愈伤组织进行真空和搅拌孵育对提高转化效率有促进作用，主要因为真空处理可增加愈伤组织表面创伤，使农杆菌更容易进入到愈伤组织内并整合到植物基因组上，搅拌处理则是通过增大愈伤组织与农杆菌的接触面积提高转化效率.在农杆菌转化前对愈伤组织进行预培养，可改善愈伤组织的生长状态，有利于获得最佳转化效率.在建立羊草遗传转化体系时，使用携带Ib2-Cys prx基因的载体pCAMBIA 2300转化根癌农杆菌菌株EHA105，活化菌液至OD600值为0.4，将预培养7 d后的胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液孵育20 min，最優转化条件为共培养3 d，获得8.97%的转化效率[26].这表明：生长状态良好、分化力强的愈伤组织具有活跃的基因整合能力，明显有利于提高转化效率.在农杆菌介导的转化过程中，不同受体材料的最适转化条件存在差异.在黑麦草遗传转化体系中，使用农杆菌AGL1转化携带SOS1，SOS2，SOS3，CBL10和BAR基因的耐盐多基因植物表达载体pSOS，将成熟种子诱导的胚性愈伤组织浸泡在OD600值为0.3～0.6的农杆菌菌液中孵育20 min，经2 d共培养后得到22.8%的最高转化效率[27];而在农杆菌介导结缕草匍匐茎节进行遗传转化过程中，将二元载体pCAMBIA 1301，pCAMBIA 1304和pCAMBIA 1305.2导入根癌农杆菌菌株EHA105用于转化，将茎节浸泡在OD600值为1.0的农杆菌菌液中真空孵育10 min，然后浸泡孵育50 min，共培养2 d后，其转化效率最高为10.5%～13.7%[20].3 乙酰丁香酮浓度在农杆菌转化植物材料的过程中需要酚类化合物诱导完成，仅靠植物材料自身分泌是远远不够的，需要人为添加.乙酰丁香酮是农杆菌转化单子叶植物过程中常用的酚类化合物.乙酰丁香酮通过诱导农杆菌Vir区VirA基因自身磷酸化，并激活VirG基因产物，从而激活其他Vir 基因转录，增强T-DNA加工与转移，使农杆菌T-DNA更容易进入植物基因组并与其整合[28-29].共培养阶段是T-DNA转移和整合的关键时期.不同植物的遗传转化体系中的乙酰丁香酮浓度存在差异.建立金发草遗传转化体系时，选择物质的量浓度为20 μmol∙L-1的乙酰丁香酮加入共培养基中作为最优转化条件[30];结缕草遗传转化体系建立的过程中，在共培养的培养基中添加50 μmol∙L-1的乙酰丁香酮达到最大转化率[31].农杆菌介导的黑麦草遗传转化过程中，通过在共培养基中添加200 μmol∙L-1的乙酰丁香酮诱导以提高转化效率[11].在农杆菌转化双花草时则选择在共培养的培养基中添加400μmol∙L-1的乙酰丁香酮[32].在柳枝稷、高羊茅和匍匐剪股颖的遗传转化过程中，都选择了100 μmol∙L-1作为乙酰丁香酮的最适合物质的量浓度[33-34，16].植物受体材料、转化条件、共培养时间、乙酰丁香酮浓度、抑菌剂浓度、筛选剂选择压等因素对农杆菌介导遗传转化都有一定影响.本文作者将系统介绍各因素对农杆菌介导的禾本科植物遗传转化体系的影响.1 植物受体的选择植物受体的选择是影响农杆菌转化的一个重要因素.分裂时期细胞具有分生能力强、生长旺盛的特点，选择分裂时期的组织器官或细胞作为转化受体可获得较高的转化效率，转化后植株的再生能力较强.农杆菌转化过程中，常用的受体材料包括胚性愈伤组织、幼胚、成熟胚、胚芽、茎尖、叶片等.对于不同植物，随最适外植体的选择不同，转化效率也存在明显差异.在假俭草遗传转化体系中，以种质“E126”的侧芽诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，经农杆菌转化后获得了3.6%的转化率[17];农杆菌介导的黑麦草遗传转化过程中，将成熟胚诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，获得了4.8%的转化效率[18];柳枝稷遗传转化过程中，利用Alamo品种成熟种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，转化效率为6%[19];利用匍匐剪股颖种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，转化效率高达40%，这暗示着利用胚性愈伤组织作为受体材料的遗传转化转化效率最高[16].此外，茎段具有直接生成不定芽的能力，选择结缕草直接茎段作为受体材料可以获得6.8%的转化效率[20].由此可见，对于禾本科植物而言，选择分裂能力旺盛、细胞活性高、DNA合成能力强的胚性细胞作为受体材料，更有利于农杆菌与T-DNA整合，从而提高转化效率.2 转化条件及共培养时间农杆菌介导的遗传转化体系中受体材料的转化条件与共培养时间对转化效率有明显影响.侵染方法不恰当会使农杆菌转化效率降低，侵染时间过短会使农杆菌不能充分依附到受体材料上，导致T-DNA整合效率低，侵染时间过长则容易导致农杆菌过度繁殖，抑菌难度增加，甚至导致受体材料会因农杆菌毒害而死亡.共培养时间影响农杆菌吸附和T-DNA转移[21].农杆菌必须附着在创伤部位16 h以上才能完成转移过程[22].不同作物的最优转化条件与共培养时间存在差异，同一作物不同受体材料的最优转化条件与共培养时间也不同.摸索合适的转化条件与共培养时间是建立高效转化系统所必须的（表1）.可利用冷处理、搅拌孵育和真空处理等手段提高转化效率.在朝鲜碱茅遗传转化体系建立过程中，使用含有二元载体pBI 121的根癌农杆菌菌株EHA105进行转化，当菌液在600 nm 波长处的吸光度值（OD600）达到0.8～1.0时，对成熟种子诱导的胚性愈伤组织浸泡孵育30 min可以达到最佳转化效果[23];对柳枝稷胚性愈伤组织进行遗传转化时，使用含二元载体pCAMBIA 1305.1的根癌农杆菌菌株EHA105，将冷处理20 min后的胚性愈伤组织浸入OD600值为0.5的农杆菌菌液中，经过真空孵育10 min，搅拌孵育20 min，共培养3 d后，其转化效率最高为72.8%[24].这表明：在农杆菌转化前对愈伤组织进行冷处理，可大幅度减少农杆菌侵染后愈伤组织的褐变[25];而转化过程中对愈伤组织进行真空和搅拌孵育对提高转化效率有促进作用，主要因為真空处理可增加愈伤组织表面创伤，使农杆菌更容易进入到愈伤组织内并整合到植物基因组上，搅拌处理则是通过增大愈伤组织与农杆菌的接触面积提高转化效率.在农杆菌转化前对愈伤组织进行预培养，可改善愈伤组织的生长状态，有利于获得最佳转化效率.在建立羊草遗传转化体系时，使用携带Ib2-Cys prx基因的载体pCAMBIA 2300转化根癌农杆菌菌株EHA105，活化菌液至OD600值为0.4，将预培养7 d后的胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液孵育20 min，最优转化条件为共培养3 d，获得8.97%的转化效率[26].这表明：生长状态良好、分化力强的愈伤组织具有活跃的基因整合能力，明显有利于提高转化效率.在农杆菌介导的转化过程中，不同受体材料的最适转化条件存在差异.在黑麦草遗传转化体系中，使用农杆菌AGL1转化携带SOS1，SOS2，SOS3，CBL10和BAR基因的耐盐多基因植物表达载体pSOS，将成熟种子诱导的胚性愈伤组织浸泡在OD600值为0.3～0.6的农杆菌菌液中孵育20 min，经2 d共培养后得到22.8%的最高转化效率[27];而在农杆菌介导结缕草匍匐茎节进行遗传转化过程中，将二元载体pCAMBIA 1301，pCAMBIA 1304和pCAMBIA 1305.2导入根癌农杆菌菌株EHA105用于转化，将茎节浸泡在OD600值为1.0的农杆菌菌液中真空孵育10 min，然后浸泡孵育50 min，共培养2 d后，其转化效率最高为10.5%～13.7%[20].3 乙酰丁香酮浓度在农杆菌转化植物材料的过程中需要酚类化合物诱导完成，仅靠植物材料自身分泌是远远不够的，需要人为添加.乙酰丁香酮是农杆菌转化单子叶植物过程中常用的酚类化合物.乙酰丁香酮通过诱导农杆菌Vir区VirA基因自身磷酸化，并激活VirG基因产物，从而激活其他Vir 基因转录，增强T-DNA加工与转移，使农杆菌T-DNA更容易进入植物基因组并与其整合[28-29].共培养阶段是T-DNA转移和整合的关键时期.不同植物的遗传转化体系中的乙酰丁香酮浓度存在差异.建立金发草遗传转化体系时，选择物质的量浓度为20 μmol∙L-1的乙酰丁香酮加入共培养基中作为最优转化条件[30];结缕草遗传转化体系建立的过程中，在共培养的培养基中添加50 μmol∙L-1的乙酰丁香酮达到最大转化率[31].农杆菌介导的黑麦草遗传转化过程中，通过在共培养基中添加200 μmol∙L-1的乙酰丁香酮诱导以提高转化效率[11].在农杆菌转化双花草时则选择在共培养的培养基中添加400μmol∙L-1的乙酰丁香酮[32].在柳枝稷、高羊茅和匍匐剪股颖的遗传转化过程中，都选择了100 μmol∙L-1作为乙酰丁香酮的最适合物质的量浓度[33-34，16].植物受体材料、转化条件、共培养时间、乙酰丁香酮浓度、抑菌剂浓度、筛选剂选择压等因素对农杆菌介导遗传转化都有一定影响.本文作者将系统介绍各因素对农杆菌介导的禾本科植物遗传转化体系的影响.1 植物受体的选择植物受体的选择是影响农杆菌转化的一个重要因素.分裂时期细胞具有分生能力强、生长旺盛的特点，选择分裂时期的组织器官或细胞作为转化受体可获得较高的转化效率，转化后植株的再生能力较强.农杆菌转化过程中，常用的受体材料包括胚性愈伤组织、幼胚、成熟胚、胚芽、茎尖、叶片等.对于不同植物，随最适外植体的选择不同，转化效率也存在明显差异.在假俭草遗传转化体系中，以种质“E126”的侧芽诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，经农杆菌转化后获得了3.6%的转化率[17];农杆菌介导的黑麦草遗传转化过程中，将成熟胚诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，获得了4.8%的转化效率[18];柳枝稷遗传转化过程中，利用Alamo品种成熟种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，转化效率为6%[19];利用匍匐剪股颖种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，转化效率高达40%，这暗示着利用胚性愈伤组织作为受体材料的遗传转化转化效率最高[16].此外，茎段具有直接生成不定芽的能力，选择结缕草直接茎段作为受体材料可以获得6.8%的转化效率[20].由此可见，对于禾本科植物而言，选择分裂能力旺盛、细胞活性高、DNA合成能力强的胚性细胞作为受体材料，更有利于农杆菌与T-DNA整合，从而提高转化效率.2 转化条件及共培养时间农杆菌介导的遗传转化体系中受体材料的轉化条件与共培养时间对转化效率有明显影响.侵染方法不恰当会使农杆菌转化效率降低，侵染时间过短会使农杆菌不能充分依附到受体材料上，导致T-DNA整合效率低，侵染时间过长则容易导致农杆菌过度繁殖，抑菌难度增加，甚至导致受体材料会因农杆菌毒害而死亡.共培养时间影响农杆菌吸附和T-DNA转移[21].农杆菌必须附着在创伤部位16 h以上才能完成转移过程[22].不同作物的最优转化条件与共培养时间存在差异，同一作物不同受体材料的最优转化条件与共培养时间也不同.摸索合适的转化条件与共培养时间是建立高效转化系统所必须的（表1）.可利用冷处理、搅拌孵育和真空处理等手段提高转化效率.在朝鲜碱茅遗传转化体系建立过程中，使用含有二元载体pBI 121的根癌农杆菌菌株EHA105进行转化，当菌液在600 nm 波长处的吸光度值（OD600）达到0.8～1.0时，对成熟种子诱导的胚性愈伤组织浸泡孵育30 min可以达到最佳转化效果[23];对柳枝稷胚性愈伤组织进行遗传转化时，使用含二元载体pCAMBIA 1305.1的根癌农杆菌菌株EHA105，将冷处理20 min后的胚性愈伤组织浸入OD600值为0.5的农杆菌菌液中，经过真空孵育10 min，搅拌孵育20 min，共培养3 d后，其转化效率最高为72.8%[24].这表明：在农杆菌转化前对愈伤组织进行冷处理，可大幅度减少农杆菌侵染后愈伤组织的褐变[25];而转化过程中对愈伤组织进行真空和搅拌孵育对提高转化效率有促进作用，主要因为真空处理可增加愈伤组织表面创伤，使农杆菌更容易进入到愈伤组织内并整合到植物基因组上，搅拌处理则是通过增大愈伤组织与农杆菌的接触面积提高转化效率.在农杆菌转化前对愈伤组织进行预培养，可改善愈伤组织的生长状态，有利于获得最佳转化效率.在建立羊草遗传转化体系时，使用携带Ib2-Cys prx基因的载体pCAMBIA 2300转化根癌农杆菌菌株EHA105，活化菌液至OD600值为0.4，将预培养7 d后的胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液孵育20 min，最优转化条件为共培养3 d，获得8.97%的转化效率[26].这表明：生长状态良好、分化力强的愈伤组织具有活跃的基因整合能力，明显有利于提高转化效率.在农杆菌介导的转化过程中，不同受体材料的最适转化条件存在差异.在黑麦草遗传转化体系中，使用农杆菌AGL1转化携带SOS1，SOS2，SOS3，CBL10和BAR基因的耐盐多基因植物表达载体pSOS，将成熟种子诱导的胚性愈伤组织浸泡在OD600值为0.3～0.6的农杆菌菌液中孵育20 min，经2 d共培养后得到22.8%的最高转化效率[27];而在农杆菌介导结缕草匍匐茎节进行遗传转化过程中，将二元载体pCAMBIA 1301，pCAMBIA 1304和pCAMBIA 1305.2导入根癌农杆菌菌株EHA105用于转化，将茎节浸泡在OD600值为1.0的农杆菌菌液中真空孵育10 min，然后浸泡孵育50 min，共培养2 d后，其转化效率最高为10.5%～13.7%[20].3 乙酰丁香酮浓度在农杆菌转化植物材料的过程中需要酚类化合物诱导完成，仅靠植物材料自身分泌是远远不够的，需要人为添加.乙酰丁香酮是农杆菌转化单子叶植物过程中常用的酚类化合物.乙酰丁香酮通过诱导农杆菌Vir区VirA基因自身磷酸化，并激活VirG基因产物，从而激活其他Vir 基因转录，增强T-DNA加工与转移，使农杆菌T-DNA更容易进入植物基因组并与其整合[28-29].共培养阶段是T-DNA转移和整合的关键时期.不同植物的遗传转化体系中的乙酰丁香酮浓度存在差异.建立金发草遗传转化体系时，选择物质的量浓度为20 μmol∙L-1的乙酰丁香酮加入共培养基中作为最优转化条件[30];结缕草遗传转化体系建立的过程中，在共培养的培养基中添加50 μmol∙L-1的乙酰丁香酮达到最大转化率[31].农杆菌介导的黑麦草遗传转化过程中，通过在共培养基中添加200 μmol∙L-1的乙酰丁香酮诱导以提高转化效率[11].在农杆菌转化双花草时则选择在共培养的培养基中添加400μmol∙L-1的乙酰丁香酮[32].在柳枝稷、高羊茅和匍匐剪股颖的遗传转化过程中，都选择了100 μmol∙L-1作为乙酰丁香酮的最适合物质的量浓度[33-34，16].植物受体材料、转化条件、共培养时间、乙酰丁香酮浓度、抑菌剂浓度、筛选剂选择压等因素对农杆菌介导遗传转化都有一定影响.本文作者将系统介绍各因素对农杆菌介导的禾本科植物遗传转化体系的影响.1 植物受体的选择植物受体的选择是影响农杆菌转化的一个重要因素.分裂时期细胞具有分生能力强、生长旺盛的特点，选择分裂时期的组织器官或细胞作为转化受体可获得较高的转化效率，转化后植株的再生能力较强.农杆菌转化过程中，常用的受体材料包括胚性愈伤组织、幼胚、成熟胚、胚芽、茎尖、叶片等.对于不同植物，随最适外植体的选择不同，转化效率也存在明显差异.在假俭草遗传转化体系中，以种质“E126”的侧芽诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，经农杆菌转化后获得了3.6%的转化率[17];农杆菌介导的黑麦草遗传转化过程中，将成熟胚诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，获得了4.8%的转化效率[18];柳枝稷遗传转化过程中，利用Alamo品种成熟种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，转化效率为6%[19];利用匍匐剪股颖种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，转化效率高达40%，这暗示着利用胚性愈伤组织作为受体材料的遗传转化转化效率最高[16].此外，茎段具有直接生成不定芽的能力，选择结缕草直接茎段作为受体材料可以获得6.8%的转化效率[20].由此可见，对于禾本科植物而言，选择分裂能力旺盛、细胞活性高、DNA合成能力强的胚性细胞作为受体材料，更有利于农杆菌与T-DNA整合，从而提高转化效率.2 转化条件及共培养时间农杆菌介导的遗传转化体系中受体材料的转化条件与共培养时间对转化效率有明显影响.侵染方法不恰当会使农杆菌转化效率降低，侵染时间过短会使农杆菌不能充分依附到受体材料上，导致T-DNA整合效率低，侵染时间过长则容易导致农杆菌过度繁殖，抑菌难度增加，甚至导致受体材料会因农杆菌毒害而死亡.共培养时间影响农杆菌吸附和T-DNA转移[21].农杆菌必须附着在创伤部位16 h以上才能完成转移过程[22].不同作物的最优转化条件与共培养时间存在差异，同一作物不同受体材料的最优转化条件与共培养时间也不同.摸索合适的转化条件与共培养时间是建立高效转化系统所必须的（表1）.可利用冷处理、搅拌孵育和真空处理等手段提高转化效率.在朝鲜碱茅遗传转化体系建立过程中，使用含有二元载体pBI 121的根癌农杆菌菌株EHA105进行转化，当菌液在600 nm 波长处的吸光度值（OD600）达到0.8～1.0时，对成熟种子诱导的胚性愈伤组织浸泡孵育30 min可以达到最佳转化效果[23];对柳枝稷胚性愈伤组织进行遗传转化时，使用含二元载体pCAMBIA 1305.1的根癌农杆菌菌株EHA105，将冷处理20 min后的胚性愈伤组织浸入OD600值为0.5的农杆菌菌液中，经过真空孵育10 min，搅拌孵育20 min，共培养3 d后，其转化效率最高为72.8%[24].这表明：在农杆菌转化前对愈伤组织进行冷处理，可大幅度减少农杆菌侵染后愈伤组织的褐变[25];而转化过程中对愈伤组织进行真空和搅拌孵育对提高转化效率有促进作用，主要因为真空处理可增加愈伤组织表面创伤，使农杆菌更容易进入到愈伤组织内并整合到植物基因组上，搅拌处理则是通过增大愈伤组织与农杆菌的接触面积提高转化效率.在农杆菌转化前对愈伤组织进行预培养，可改善愈伤组织的生长状态，有利于获得最佳转化效率.在建立羊草遗传转化体系时，使用携带Ib2-Cys prx基因的载体pCAMBIA 2300转化根癌农杆菌菌株EHA105，活化菌液至OD600值为0.4，将预培养7 d后的胚性愈伤组织浸入农。

梢物学报C/7/nese i5iy//e f/>7 of 8o(any 2021, 56 (1): 50-55, doi: 10.11983/CBB21009•特邀专家方法•基于双碱基编辑系统的植物基因靶向随机突变技术张瑞，高彩霞中国科学院种子创新研宂院，遗传与发育生物学研宄所，植物细胞y染色体工程国家重点实验室，基因组编辑屮心，北京100101摘要遗传性变异是表型多样性的基础，靶向饱和突变作物基因可以促进产生具有优异农艺性状的突变体。

相较于传统诱 变育种和异源物种中的定向进化方法，基于双碱基编辑系统的植物基因靶向随机突变技术可对植物内源基因产生高效突 变，从而实现原位定向进化，加快植物育种及功能基因研宄进程。

该文介绍了使用饱和靶向内源基因突变编辑器(STEME)对植物功能基因进行靶向随机突变的具体操作方法，从靶点设计和突变体检测方面进行了详细描述。

关键词基因编辑，碱基编辑，靶向随机突变，植物基因定向进化张瑞，高彩霞（2021).基于双碱基编辑系统的植物基因靶向随机突变技术.植物学报56, 50-55.遗传变异是自然界物种形成和进化的基础，也是 物种性状多样性产生的原因。

目前，在作物中通过突 变筛选优异性状的方法主要是诱变育种，即通过物理 及化学方法(如辐射和EMS诱变)产生全基因组的随 机突变，再从突变体中选取表现优异的个体进行新品 种的培育(Henikoff et al., 2004; Slade et al., 2005; 卩3〇116「31^?11£±^3,2017)»由〗''诱变产生频率较低,且变异方向和性质难以控制，因此传统的诱变育种方 法通常费时费力。

定向进化则通过创制目标基因的突 变文库，在施加一定选择压力下能够快速获得目的突 变体(Packer and Liu,2015)。

植物基因的定向进化通 常先通过易错PCR、DNA合成或DNA重组等方法在 体外产生目标基因的突变文库，之后转化到大肠杆 \%\(Escherichia coli)sS,MMP}(Saccharomyces cere-w_s/_ae)中进行功能筛选(Engqvist and Rabe,2019)。

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2017, 43(2): 157 170/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家重点研发计划专项(2016YFD0100300)资助。

The Principal Investigator was supported by the National Research and Development Program (2016YFD0100300).*通讯作者(Corresponding author): 张学勇, E-mail: zhangxueyong@Received(收稿日期): 2016-09-22; Accepted(接受日期): 2016-11-03; Published online(网络出版日期): 2016-11-18. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20161118.1356.002.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2017.00157作物驯化和品种改良所选择的关键基因及其特点张学勇1,* 马 琳1 郑 军21中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 2山西省农业科学院小麦研究所, 山西临汾 041000摘 要: 近15~20年作物基因组学迅速发展, 特别是第2代测序技术的普及, 显著降低了测序成本, 使单核苷酸多态性(SNP)分析和单元型区段(也称单倍型区段)分析渗透到生命科学的各个领域, 对系统生物学、遗传学、种质资源学和育种学影响最为深刻, 使其进入基因组学的全新时代。

一批驯化选择基因的克隆, 特别是对一些控制复杂性状形成的遗传基础及其调控机制的解析, 更清晰地揭示了作物驯化和品种改良的历史, 提升了人们对育种的认知, 推动育种方法的改进。

驯化和育种既有相似之处, 也存在明显的差异。

驯化选择常常发生在少数关键基因或位点, 对基因的选择几乎是一步到位; 而现代作物育种虽然只有100年左右的历史, 但其对基因组影响更为强烈, 是一些重要代谢途径不断优化的过程。