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2008 纳豆菌高产培养基的成分优化

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纳豆激酶产生菌的固体发酵参数优化

纳豆激酶产生菌的固体发酵参数优化

作者简介：周伏忠 （９ ５ ） 男 ， １６ 一 ， 河南浚 县人 ， 研究员 ， 硕士 ， 究方向为微生物发酵工程 ． 研
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９ ２— ３ —
河
南 科
学
第发酵 结束 后 ， 每 克 固体发 酵成 熟 物加 入质 量 分数 为 ０９％生 理盐 水 ５ｍＬ４℃浸 提 ４ｈ４５０ｒ ｉ 在 ． ， ， ０ ｍｎ离 ／ 心 ２ ｉ， ０ｍｎ 上清 液 即为 固体 发酵粗 酶溶 液 ．参照 文献 ［］ ３ 的方 法 制备 血纤 维 蛋 白平板 和尿 激 酶标 准 曲线 ． 用 微量 加样 器移 取 适量 （～ ０ ） 酶 液 点种 于纤 维 蛋 白平板 上 ， 好标 记 ，７℃保温 １ ， ５ １ Ｌ 粗 做 ３ ８ｈ 测量 透 明 圈直 径 ， 计算 溶解 圈面 积 ， 与标 准 曲线 比对 ， 算酶 活 力 ． 计
13培养基质量分数131种子培养基lb胰蛋白胨1酵母浸出物05nacl1ph70132固体发酵培养基根据本实验室液体发酵研究的结果007mgso实验方法21斜面培养将接种好的斜面于37恒温培养箱培养24h22种子培养在250ml三角瓶中装20ml种子培养基接种一环斜面菌种于37恒温摇床150rmin培养14h23固体发酵每250ml三角瓶固体发酵培养基中加入固体培养基20g其他组分的变化见各个实验组
Ｍｇ Ｏ，． ＫＨＰ ０２％ ＫＨ Ｏ ．其他 组 分见 各实验 组 ． Ｓ ４０４％ ２ Ｏ 和 ． ２Ｐ
２ 实验方法
２１ 斜 面培 养 ． 将 接种 好 的斜 面于 ３ 恒 温培 养箱 培养 ２ ． ７ｑ Ｃ ４ｈ ２２ 种 子培 养 ．
在 ２０ Ｌ ５ 三角瓶中装 ２ Ｌ种子培养基， ｍ ０ ｍ 接种一环斜面菌种， ３ 恒温摇床 １０ ／ ｉ 培养 １ ． 于 ７Ｃ ｑ ５ ｍｎ ｒ ４ ｈ ２３ 固体 发酵 ．

高产纳豆激酶地衣芽孢杆菌工程菌全合成培养基优化

高产纳豆激酶地衣芽孢杆菌工程菌全合成培养基优化

高产纳豆激酶地衣芽孢杆菌工程菌全合成培养基优化赵新宇;陈杨阳;陈敬帮;蔡冬波;魏雪团【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2016(037)007【摘要】以产纳豆激酶的地衣芽孢杆菌基因工程菌BL10 (pP43SNT-SsacC)为出发菌株,开展其全合成培养基的发酵优化研究.通过单因素试验和正交试验优化了全合成培养基成分,获得了最优的培养基组成(g/L):葡萄糖30、NaNO330、谷氨酸钠20、柠檬酸钠15、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO4·3H2O 1.5、CaCl20.5,pH 7.2.在优化的全合成培养基中,纳豆激酶最高酶活力达到25.59 FU/mL,相比于初始培养基发酵活性(4.27 FU/mL),提高了5倍.对比分析了全合成培养基和半合成培养基的发酵产物,结果表明,全合成培养基可显著提高纳豆激酶的纯度,与半合成培养基相比,纳豆激酶比活力提高了2倍.本研究获得了纳豆激酶的全合成培养基成分,显著提高了纳豆激酶发酵活性,并进一步提高了纳豆激酶发酵纯度.【总页数】6页(P140-145)【作者】赵新宇;陈杨阳;陈敬帮;蔡冬波;魏雪团【作者单位】华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070;华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉 430070;华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉 430070;华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉430070;华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉 430070;华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070;华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉 430070【正文语种】中文【中图分类】Q812【相关文献】1.地衣芽胞杆菌工程菌高产纳豆激酶的发酵罐工艺优化及中试放大 [J], 祝亚娇;宋嘉宾;陈杨阳;孙炳刚;陈敬帮;魏雪团2.地衣芽孢杆菌YTDY_01高产芽孢的培养基优化 [J], 解顺昌[1,2];刘扬科;胡国春;成鹏;路广亮;李林;3.高产地衣芽孢杆菌LB8培养基的优化研究 [J], 张晓晴;闵钟熳4.产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵条件的\r响应面优化 [J], 田莉;卢轶男;朱建;张佑红5.具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的优化 [J], 童文涛; 陈彪; 彭孟凡; 赵祯; 肖翎; 宋增福; 张庆华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

纳豆激酶高产菌株筛选及发酵条件优化

纳豆激酶高产菌株筛选及发酵条件优化
1000 800 600 400 200 0 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8
3.5.4
图 3 碳源对纳豆激酶活性的影响 Fig 3 The effect of nattokinase activity by carbon source
从图 3 可知，以甘油和蔗糖为碳源时，纳豆激酶 活性相对较高。同时考虑工业生产成本问题，故选用 蔗糖作为培养碳源。 3.5.2 氮源选择 由于本菌从大豆发酵制品中分离得到，所以选择 2 %的大豆、豆粕及蛋白酶处理的大豆及豆粕作为氮 源，24 h 后比较活性变化，结果见图 4。由结果可知， 用豆粕发酵时纳豆激酶活性相对较高。
图 6 初始 pH 对纳豆激酶活性的影响 Fig.6 The effect of nattokinase activity by pH
3.5.5 单因素正交实验 对碳源（蔗糖） 、氮源（豆粕） 、温度、起始 pH 4 四个因素，设计正交实验表 L9(3 )(见表 1)。 利用 DPS 数据处理软件对正交试验结果进行正 交试验方差分析，比较各列的极差 R 值，可以看出 RA>RB>RC>RD，即在实验所设定的各因素中，碳源对 纳豆激酶活性影响最大， 次是氮源和发酵温度， 而 pH 从而得到该 的影响较小， 最佳因素组合为 A2B2C2D2。 优化培养基（ZD）由 2 %蔗糖和 2 %豆粕组成，发酵 温度为 37 ℃，起始 pH 为 7.0。
Abstract: Fifteen Nattokinase-producing strains separated from Japanese food-natto were investigated in this study. The strain N-15 was selected from the examined striains for its high level of nattokinase-producing activity (900IU/mL). The fermention conditions of the strain N-15 for the nattokinase production were optimized by single factor and orthogonal tests. It was found that the optimal soybean residue content, sucrose content, incubation temperature and the original pH value were 20 %, 2 %, 37 ℃and 7.0, respectively. Under the optimized fermentation conditions, Nattokinase was produced with a high activity level of 1033 IU/mL. Key words: nattokinase; Bacillus natto; screened selection; optimization

纳豆芽孢杆菌流加培养的初步研究

纳豆芽孢杆菌流加培养的初步研究

纳豆芽孢杆菌流加培养的初步研究
杨旭;谷军;张晓彦
【期刊名称】《中国调味品》
【年(卷),期】2013(038)003
【摘要】目的:研究制作纳豆用芽孢杆菌液体深层发酵的优化方法,提高发酵水平,生产出含有较高活菌数的微生物菌剂产品.方法:采用L8(27)正交实验法优化芽孢杆菌的液体深层发酵培养基；通过不同的补料发酵方式,降低营养物质过浓产生的阻碍作用,提高发酵浓度和水平.结果:对纳豆芽孢杆菌的摇瓶发酵培养基进行了优化,优化后的培养基为葡萄糖3％、酵母粉1.5％、豆饼粉0.2％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％.通过2L发酵罐的补料发酵试验得出最佳的补料方式:液体深层发酵10 h以后开始补料,每15 min补一次,10 h补完,补料液的养分为葡萄糖和酵母粉含量为总发酵成分的33％.
【总页数】4页(P25-27,35)
【作者】杨旭;谷军;张晓彦
【作者单位】黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨 150010
【正文语种】中文
【中图分类】TS264.2
【相关文献】
1.纳豆芽孢杆菌发酵液抑菌物质的提取与初步分析 [J], 陈茜;汪建明;胡可眉
2.基于DO-stat流加培养控制的海藻糖合成酶发酵条件研究 [J], 段莹莹;曹大鹏;
任峰;张曰辉;赵伟
3.红曲霉色素流加培养的初步研究 [J], 杨旭;曹岚;李旭
4.纳豆芽孢杆菌胞壁肽聚糖提取工艺优化及其结构初步鉴定 [J], 陈佳妮;黄占旺;王素贞;石福磊;黄永平
5.纳豆芽孢杆菌发酵厨余物的初步研究 [J], 谢晨晨;刘敬为;张怡;刘天美;刘朝阳;黄亮;童应凯
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犊牛饲用纳豆枯草芽孢杆菌液体培养条件的优化

犊牛饲用纳豆枯草芽孢杆菌液体培养条件的优化

★ 国 际科 技 合 作 重 点 项 目“ 牛奶 安 全 饲 用微 生 物及 其 人 工瘤 杆 菌对 增强 犊 牛机 体 免疫 和 促 进 胃肠 发育 具 有 良好
胃评 价 技 术研 究 ”２ ０ Ｄ Ａ ６０ ）和 国 家科 技 支撑 计 划 的 效 果 。 （０４ Ｆ ０７０ “ 刍、 水 产 等 动 物 配 合 饲 料 生 产 技 术 集 成 与 产 业 化 示 反
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《 同捌工业》２０ ・０８芷第 ２ 酋第 期
试
犊牛饲 用纳豆枯革 芽孢杆漕 臻嫱． 条 件 蘸 ． 养 的优 匕
邓 露芳 王加启 姜艳 美 卜登攀 魏 宏阳 周凌云 王金菌作 为犊 牛 直接 饲 用微 生物 对增 强犊 牛机 体 免 疫和 促 进 胃肠 发 育有
严 ３ ］ 。作 邓 露 芳 ， 国农 业科 学 院 北 京 畜牧 兽 医研 究 所 国家 动 物 营 从而 引起 犊 牛 胃肠疾 病 ， 重 时甚 至造 成 死亡 【 中
养学重点实验 室，０ ０４ 北京 。 １０ ９ ，
为 可 直 接 饲 用 微 生 物 ， 纳 豆 芽 孢 杆 菌 能 在 肠 道 内生
尚未 建立 完 全 ， 胃蛋 白酶产 生较 晚 ， 固体物 质 和非 对 乳 物 质 的消 化 能力 弱 ； 免疫 系统 功 能 不完 善 ， 胃及肠
对 细 菌 的抵抗 力 很 弱 ， 疾 病 的能 力 较差 ， 界 环境 抗 外 不 良 时 ， 被 大 肠 杆 菌 、 门 氏杆 菌等 病 原 菌 侵袭 ， 易 沙
益， 然而 以豆类物质 为发 酵底 物 的微 生 物制剂 不适 用于犊牛 。 本研 究 采用纳豆 枯草 芽孢杆 茵液体培养 方法 ， 对培 养条件 的 氮源 、 源、 茵量 、 液量 、 碳 接 装 转速 和 温度进 行 正 交试 验 ， 结果 表 明 ， 葡 萄糖 １ 在 ％、

纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基的优化_帅明

纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基的优化_帅明

纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基的优化帅明黄占旺牛丽亚（江西农业大学食品科学与工程学院南昌330045）摘要为优化纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基，采用微生物固态发酵技术，以固态发酵后的活菌数、芽孢数、蛋白酶及α-淀粉酶活力为指标，对纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基组成及配比，添加碳源、氮源种类及浓度，培养基的含水量进行优化研究。

试验结果表明，在玉米粉与麦麸配比3∶7、葡萄糖2%、硝酸铵0.5%、水60%条件下发酵效果最好。

关键词纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基文章编号1009-7848（2009）01-0143-05纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto ）具有改善宿主肠道微生物菌群平衡的功能[1]，近年来被广泛用于食品行业和养殖业。

纳豆芽孢杆菌是从日本的发酵食品———纳豆中发现并分离出来的，属细菌科、芽孢杆菌属，其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种[2]。

纳豆芽孢杆菌具有溶血栓、降血压、抗肿瘤、抗菌、防止骨质疏松、调节肠道内环境等功能[3]，是近年来研究的热点。

目前的研究主要集中在纳豆激酶高产菌株的筛选、溶栓作用等方面，对其固态发酵技术的研究较少。

本文对纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基进行优化，为工业大规模生产提供理论和技术支持。

1材料与方法1.1材料1.1.1发酵培养基麦麸、玉米粉、豆渣、豆粕，购于农大农贸市场。

1.1.2菌种来源纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto ）B1由江西农业大学食品微生物实验室人员分离保存。

1.1.3菌种培养基[4]牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基。

1.1.4试剂葡萄糖、乳糖、蔗糖、棉子糖、尿素、硫酸铵、硝酸铵，均为分析纯试剂。

1.2仪器与设备754紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；SPX-150B 生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；HZQ-F160全温振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术公司；101A-4B 电热鼓风干燥箱，上海实验仪器总厂；LDZX-40B 自动立式电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；HH －2数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

一种纳豆菌培养基及其优化方法[发明专利]

专利名称：一种纳豆菌培养基及其优化方法专利类型：发明专利
发明人：王国栋,刘书梅,杜磊
申请号：CN201710586418.9
申请日：20170718
公开号：CN107129956A
公开日：
20170905
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及纳豆食品开发领域，特别是涉及一种纳豆菌培养基及其优化方法。

本发明提供了一种纳豆菌培养基的配方，由以下成分组成：4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠萝皮汁、
0.2％MgSO、0.1％KHPO、0.2％KHPO。

本发明对目前培养效果较好的培养基进行优化，选择更为高效的常见碳源和氮源作为基础培养基中的碳源和氮源的替代物，添加常见的水果蔬菜汁作为纳豆菌的生长因子，采用单因素试验筛选出最适宜浓度的碳源、氮源、生长因子，利用正交试验进行进一步筛选，最终选出最适合纳豆菌生长、增菌效果最好的培养基。

申请人：安阳工学院
地址：455099 河南省安阳市黄河大道安阳工学院
国籍：CN
代理机构：北京权智天下知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：王新爱
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2008 纳豆菌高产培养基的成分优化


３．０
２．５
２．０
１％大 豆 蛋 白 胨
１．５
３％大 豆 蛋 白 胨
１．０
５％大 豆 蛋 白 胨
７％大 豆 蛋 白 胨 ０．５
０ ０ ６ １２ １８ ２４ ３０ ３６ 培 养 时 间／ｈ
图 ４ 氮源浓度对菌种生长的影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
一般来说， Ｇ＋对镁离子的需要量比 Ｇ－ 大。本试 验菌株为革兰氏阳性菌（ Ｇ＋） ， 因此， ＭｇＳＯ４ 浓度是 影响菌种生长的因素之一。 ２．５．２ Ｋ２ＨＰＯ４ 和 ＫＨ２ＰＯ４ 浓度 将基础种子培养 基 中 的 ０．５％ ＮａＣｌ 用 不 同 浓 度 比 的 Ｋ２ＨＰＯ４ 和 ＫＨ２ＰＯ４ 代替， 其它 成 分 不 变 ， 接 种 培 养 ， 每 隔 ２ ｈ 测定其生物量并绘制生长曲线 （ 见图 ６） 。由图 ６ 可 知 ， Ｋ２ＨＰＯ４ 与 ＫＨ２ＰＯ４ 的 适 宜 浓 度 比 为 １∶１， 在 培 养 １２ ｈ 时 达 到 最 大 生 长 量 ， 其 ＯＤ６００ 值 为 ２．２２２， 明显优于其它浓度比的， 且提前 ２ ｈ 达到最 大生长量。
豆粕粉
硝酸铵 ０．５
０ ０ ４ ８ １２ １６ ２０ ２４ 培 养 时 间／ｈ
图 ２ 氮源种类对菌种生长的影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ
生物量（ ＯＤ６００） 生物量（ ＯＤ６００）
２．３ 碳源浓度对菌种生长的影响 培 养 基 中 大 豆 蛋 白 胨 质 量 分 数 固 定 为 １％，
分不变， 接种培养， 每隔 ２ ｈ 测定生物量并绘制生 长曲线。由图 ２ 可知， 大豆蛋白胨作为种子培养基 的氮源优于其它种类的氮源。菌种对无机氮源利 用 速 度 较 慢 ， 对 豆 粕 粉 的 利 用 速 度 更 慢 ， 其 ＯＤ６００ 一直处于较低的水平。

纳豆激酶发酵培养基的优化

纳豆激酶发酵培养基的优化姓名: 黄江坤班级：制药132学号：201304040225纳豆激酶发酵培养基的优化一、菌种选择选用纳豆枯草杆菌为发酵菌种二、纳豆菌的特性纳豆菌，通常为（0.7-0.8）um×(2.0-3.0)um,革兰氏阳性。

生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。

芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。

生长温度最高为45-55℃，最低为5-20℃。

孢子耐热性强。

三、纳豆激酶基因的表达NK基因起始密码子为GTG,其上游1b7p处为核糖体结合位点AAAGGAG,SD序列上游为刀T含量高达2%的转录调控区域,1143bp的阅读框架编码29个氨基酸的信号肚,77个氨基酸的前导肽及275个氨基酸的成熟肽。

结构基因的3末端为连续3个终止密码子TAA、TAG、TAA,终止密码子之后一段序列可形成茎环结构,即因子非依赖性终止顺序。

NK的最初产物是381氨基酸的蛋白前体。

其中N端的1一23氨基酸残基是信号肽,24一106氨基酸残基是前导肽。

蛋白前体切除N 端的106个氨基酸残基成为275氨基酸残基的成熟纳豆激酶;而去掉信号肽的产物(含前导肽和成熟肽)称为纳豆激酶酶原。

信号肽包含一个带3个正电荷的亲水氮端以及一段不带电荷的疏水残基序列,其功能是使NK正常分泌出胞外,其切割位点位于Ala一Glu一Aal保守序列之后。

信号肽与成熟肽之间具有的前导肽具有帮助NK正常折叠形成活性构象的功能,目前己发现一些与NK基因同源的枯草杆菌素蛋白及链激酶有与此相似的前肽区域。

四、纳豆激酶的蛋白质结构及生化性质：纳豆激酶（NK）是一种丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸组成的单链多肽结构。

NK肽链无二硫键,活性中心在Asp32,His64和Ser221,与底物结合部位在Serl25,Lenl26和Glyl27处。

NK与大多数枯草杆菌蛋白酶在核苷酸序列上和肽链链氨基酸组成上具有高度同源性,它与B.subtilis1168产生的枯草杆菌蛋白酶E仅有13个核苷酸不同,在肽链组成上仅有2个氨基酸不同,它们成熟肽链一级结构的相同性为99.5%;纳豆激酶等电点为pH8.6,纳豆激酶在pH6.0一12.0范围内稳定,pH低于5.0则不稳定。

2008 纳豆菌的分离及其发酵条件的优化

由于在发酵过程中产生的液体相当粘稠 ,这使发 酵后去除菌体提取 γ2P GA 非常困难 。通过调低 p H 值 ,使γ2P GA 发生一定程度的降解 ,可明显降低发酵 液的粘度[10] ,从而减少能量消耗 。但如果溶液中离子 强度不够 ,即使是乙醇过量 ,γ2 P GA 也不能从溶液中 析出 ,需要有机溶剂和盐来共沉淀 。这可能与γ2 P GA 自身的结构有关 。 21 4 γ2PGA 的测定
将培养液稀释 25 倍后 ,以接种前培养基同样方法 稀释后为空白对照 ,用分光光度计读取 660 nm 处的 吸光值 OD660 。 11 51 2 样品成分分析
样品成分采用紫外扫描光谱法和高效液相色谱法 ( H PL C) [9 ] 分析测定 。 11 51 3 发酵液中样品含量的测定
用氨基酸分析仪分别测定发酵液水解前后谷氨酸 的含量 ,其差值即为γ2P GA 的含量 。水解条件为 :离 心除菌的上清液与 6 mol ·L - 1 HCl 按 1 ∶1 (体积比) 加入水解管中密封后于 110 ℃水解 12 h 。
增大 ,当蛋白胨浓度达到 40 g ·L - 1 后 ,γ2P GA 产量增 幅渐趋平缓 。从经济角度考虑 ,选择适宜蛋白胨浓度 为 40 g ·L - 1 。
mai丽等 :纳豆菌的分离及其发酵条件的优化/ 2008 年第 10 期
6 9
液体发酵培养基 ( g ·L - 1 ) :大豆蛋白胨 30 ,葡萄 糖 40 ,谷氨酸钠 30 , NaCl 15 , K2 H PO4 21 0 , KH2 PO4 41 0 ,MgSO4 01 5 ,CaCl2 01 25 及少量生物素[8 ] 。
(1) 葡萄糖浓度的影响 其它条件相同 ,添加不同浓度的葡萄糖以考察其 对γ2P GA 产量的影响 。结果见图 2 。
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图 ４ 氮源浓度对菌种生长的影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ
０．５％， 大豆蛋白胨质量分数分别为 １％、３％、５％、 ７％， 接种培养， 每隔 ２ ｈ 测定生物量并绘制生长曲 线。由图 ４ 可知， 大豆蛋白胨的适宜质量分数为 ３％， 培养 １６ ｈ 时达到最大生长量， 即 ＯＤ６００ 为 ２．６７７。 １％、５％和 ７％的大豆蛋白胨分别在 １６、２０、２０ ｈ 达 到最大生长量， 且其最大生长量均小于 ３％的大豆 蛋白胨。使用 ３％的大豆蛋白胨， 可在较短的时间 内达到最大生长量， 缩短了生产周期， 提高了设备 利用率， 降低了生产成本。
关键词 纳豆菌 培养基 二次旋转正交试验 文章编号 １００９－ ７８４８（ ２００８） ０１－ ００３３－ ０５
１９０５ 年 Ｓｈｉｎ Ｓａｗａｍｕｒａ 将产生纳豆粘性物质 的一种菌作为独立的纳豆菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ） 提出。 纳豆菌的生产菌种是从日本的一种传统大豆发酵 食品— ——纳豆中提取出来的， 它是好氧的革兰氏 阳性菌［１］， 属细菌科、芽孢杆菌属， 是枯草芽孢杆菌 的一个亚种［２］。１９８７ 年， 日本的须见洋行从纳豆中 提取出具有溶血栓功能的物质， 将其定名为纳豆 激酶［３］。经试验验证其有溶纤效果［４］， 并有望成为新 一代抗栓药物［５］。目前， 对纳豆菌生长培养基的研 究报道很少。本文研究了纳豆菌生长培养基的成 分， 为优化纳豆激酶产酶条件奠定了良好的基础。
各因素对菌种生长的贡献率依次为 ｘ２＞ｘ１＞ｘ４＞ ｘ３＞ｘ５， 即各因素对菌种生长的影响依次为大豆蛋 白胨＞葡萄糖＞Ｋ２ＨＰＯ４＞ＭｇＳＯ４＞ＫＨ２ＰＯ４。
验证试验， 分别在基础种子培养基和优化培 养基中接种， 在相同条件下培养 １４ ｈ， 测定 ＯＤ６００。 优化前、后 ＯＤ６００ 值分别为 １．８６６ 和 ２．５４０， ＯＤ６００ 值 提高了 ０．６７４， 优于五元二次旋转正交设计（ １／２） 的 ３６ 组试验。
ＮａＣｌ ０．５％， 葡萄糖质量分数分别为 ２％、３％、４％、 ５％， 接种培养， 每隔 ２ ｈ 测定生物量并绘制生长曲 线。由图 ３ 可知， 葡萄糖的最适质量分数为 ２％， 菌 种的生长量处于较高的水平。以葡萄糖作碳源， 其 菌种生长的延滞期较短， 说明菌种对于葡萄糖的 利用速度较快。 ２．４ 氮源浓度对菌种生长的影响
由图 ５ 可知， ＭｇＳＯ４ 适宜的质量分数为 ０．１％， 且在培养 １８ ｈ 达到最大生长量， 即 ＯＤ６００ 为 ２．２２５。 ０．２％ ＭｇＳＯ４ 是 在 培 养 ２２ ｈ 时 达 到 最 大 生 长 量 ， ０．０５％ ＭｇＳＯ４ 是在培养 ２０ ｈ 时达到最大生长量， 其它均在 １８ ｈ 达到最大生长量， 但其 ＯＤ６００ 值均 小于 ０．１％ ＭｇＳＯ４ 的。
豆粕粉
硝酸铵 ０．５
０ ０ ４ ８ １２ １６ ２０ ２４ 培 养 时 间／ｈ
图 ２ 氮源种类对菌种生长的影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ
生物量（ ＯＤ６００） 生物量（ ＯＤ６００）
２．３ 碳源浓度对菌种生长的影响 培 养 基 中 大 豆 蛋 白 胨 质 量 分 数 固 定 为 １％，
第８卷 第１期 ２００８ 年２月
中国食品学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ． ８ Ｎｏ． １ Ｆｅｂ． ２ ０ ０ ８
纳豆菌高产培养基的成分优化
张丽萍 １， ３ 满丽莉 ２ 马中苏 １ （ １ 吉林大学生物与农业工程学院 吉林长春 １３００２２ ２ 黑龙江农业经济职业学院 黑龙江牡丹江 １５７０００ ３ 黑龙江八一农垦大学
对回归方程求一阶偏导， 当到达局部最优点时， 导 数为零， 此计算点为驻点。经计算此驻点为极小 值， 而该方程的端点 ｆ（ ２， － ２， ２， － ２， ２） 为最大值。将 编码值换算成实际值时， 按 Ｚｊ＝Ｚ０ｊ＋ｘｊΔｊ 进行计算以 确定优化培养基成分， 即： 葡萄糖 ３％、大豆蛋白胨 ２％、ＭｇＳＯ４ ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％。
收稿日期： ２００７－ ０２－ ２８ 基金项目： 黑龙江省教育厅科学技术研究项目（ Ｎｏ． １０５４１１５０） 作者简介： 张丽萍， 女， １９５７ 年出生， 博士生， 教授 通讯作者： 马中苏
度 计 （ Ｔ６ 新 世 纪 ） ， 北 京 普 析 通 用 仪 器 有 限 公 司 ； 超级洁净工作台（ ＢＣＮ－ １３６０） ， 哈尔滨市东联电子 技 术 开 发 有 限 公 司 ； 压 力 蒸 汽 灭 菌 锅 （ ＹＸＣＥ． ＳＧ４１．２８０Ａ） ， 上海医用核子仪器厂 ； ｐＨ 计 （ ＳＧ２） ， 上海梅特勒－ 托利多仪器有限公司。 １．３ 培养方法
ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ
第８卷 第１期
纳豆菌高产培养基的成分优化
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２．５ 离子组成对菌种生长的影响 ２．５．１ ＭｇＳＯ４ 质量分数 将基础种子培养基中的 ０．５％ ＮａＣｌ 用不同质量分数的 ＭｇＳＯ４ 替代， 其它 成分不变， 接种培养后每隔 ２ ｈ 测定生物量， 绘制 生长曲线。不同 ＭｇＳＯ４ 质量分数对菌种生长的影响 见图５。
一般来说， Ｇ＋对镁离子的需要量比 Ｇ－ 大。本试 验菌株为革兰氏阳性菌（ Ｇ＋） ， 因此， ＭｇＳＯ４ 浓度是 影响菌种生长的因素之一。 ２．５．２ Ｋ２ＨＰＯ４ 和 ＫＨ２ＰＯ４ 浓度 将基础种子培养 基 中 的 ０．５％ ＮａＣｌ 用 不 同 浓 度 比 的 Ｋ２ＨＰＯ４ 和 ＫＨ２ＰＯ４ 代替， 其它 成 分 不 变 ， 接 种 培 养 ， 每 隔 ２ ｈ 测定其生物量并绘制生长曲线 （ 见图 ６） 。由图 ６ 可 知 ， Ｋ２ＨＰＯ４ 与 ＫＨ２ＰＯ４ 的 适 宜 浓 度 比 为 １∶１， 在 培 养 １２ ｈ 时 达 到 最 大 生 长 量 ， 其 ＯＤ６００ 值 为 ２．２２２， 明显优于其它浓度比的， 且提前 ２ ｈ 达到最 大生长量。
１ 材料与方法
１．１ 材料 纳豆菌 Ｔ－ ３， 本研究室工作人员自行分离。 基础种子培养基： 牛 肉 膏 ０．３％、蛋 白 胨 １％、
ＮａＣｌ ０．５％， ｐＨ ７．２～７．４， １２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。 １．２ 设备与仪器
恒温震荡培养箱（ ＨＧＣＥ－ Ｆ１６０） ， 哈尔滨市东 联电子技术开发有限公司； 电热恒温培养箱（ ＲＰ－ ９０８２） ， 上海森信实验仪器有限公司； 紫外分光光
分不变， 接种培养， 每隔 ２ ｈ 测定生物量并绘制生 长曲线。由图 ２ 可知， 大豆蛋白胨作为种子培养基 的氮源优于其它种类的氮源。菌种对无机氮源利 用 速 度 较 慢 ， 对 豆 粕 粉 的 利 用 速 度 更 慢 ， 其 ＯＤ６００ 一直处于较低的水平。
２．５
２．０
１．５
蛋白胨
大豆蛋白胨
１．０
优化培养： 在无菌条件下接种种子培养液至 装有一定量培养基的 ２５０ ｍＬ 三角瓶中， 恒温震荡 培养。 １．４ 生物量测定方法
发酵完成后， 取 １ ｍＬ 发酵液适当稀释， 以接 种前的培养基经同样方法稀释后作为空白， 用紫 外分光光度计测定菌液的 ＯＤ６００ｎｍ 值。
２ 结果与分析
２．１ 碳源种类对菌种生长的影响 将 基 础 种 子 培 养 基 中 ０．３％牛 肉 膏 更 换 为 同
ＫＨ２ＰＯ４ 的使用量采用五元二次旋转正交试验 （ １／ ２） 方法， 将单因素确定的适宜浓度作为零水平， 以 菌种培养 １４ ｈ 时的 ＯＤ６００ 为指标， 确定优化的培 养基组成。其因素水平编码及水平设置见表 １， 结 果见表 ２。
经双重显著性检验得到回归方程为： ｙ＝１．９８６＋０．０８２ｘ１－ ０．０４８ｘ２－ ０．０３８７ｘ４－ ０．０３９８ｘ５－ ０．０２１９ｘ２ｘ３－ ０．０２１５ｘ２ｘ５＋０．０２１１ｘ１２＋０．０２５６ｘ２２＋０．０３２６ ｘ３２＋ ０．０１９ｘ４２＋０．０１３８ｘ５２ 经 过 ２ 次 Ｆ 检 验 （ Ｐ＜０．０５） ， 该 方 程 拟 合 效 果 较好， 可作为优化模型。该方程局部最优点是最佳 的试验水平， 利用求偏导数的方法求解最优水平。
黑龙江大庆 １６３３１９）
摘要 为获得生长活力较强， 能够满足发酵生产纳豆激酶要求的菌种， 以 ＯＤ６００ 为评价指标， 采用测定菌种生长 曲线的方法优化培养基配比， 利用单因素试验确定适宜菌种生长的培养基成分， 并以得到的适宜条件作为五元 二次旋转正交设计的零水平进行系统优化。试验结果表明： 培养基成分的 最 优 组 合 为 葡 萄 糖 ３％、大 豆 蛋 白 胨 ２％、ＭｇＳＯ４ ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％。在优化条件下， 菌种培养 １４ ｈ 后菌液的 ＯＤ６００ 值可达到 ２．５４０， 较 优化前提高了 ０．６７４。
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表 １ 二次旋转（ １／２） 正交试验因素水平编码及水平设置 Ｔａｂｌｅ １ Ｆａｃｔｏｒ－ ｌｅｖｅｌ ｃｏｄｅ ａｎｄ ｌｅｖｅｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｏｒｄｅｒ ｒｅｖｏｌｖｉｎｇ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
培 养 基 中 葡 萄 糖 质 量 分 数 固 定 为 ２％ ， ＮａＣｌ
３．０
２．５
２．０
２％葡 萄 糖
３％葡 萄 糖
１．５
４％葡 萄 糖
５％葡 萄 糖 １．０
０．５
０ ０ ４ ８ １２ １６ ２０ ２４ 培 养 时 间／ｈ