细菌内毒素检验方法验证方案

十曩医药辱牛晕２０１４年１　１月第４卷第２１期　・药品鉴定・　酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素检查方法验证　嵇海澄　王倜　王春玲　李孝壁　江苏豪森药业股份有限公司，江苏连云港２２２０００　［摘要】目的参考ＵＳＰ、ＥＰ，探讨并建立酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素标准与检查方法（凝胶法）。方法按　《中国药典》（２０１０年版）二部附录ⅪＥ细菌内毒素检查方法进行。结果经验证，酒石酸长春瑞滨的细菌　内毒素限值确定为Ｌ＜２．ＯＩＵ／ｍｇ（以长春瑞滨计），通过稀释法可消除干扰，无干扰浓度为０．０３５ｍｇ／ｍＬ（以　长春瑞滨计）。结论可按此标准采用本法对本品进行细菌内毒素检查。　【关键词１酒石酸长春瑞滨；细菌内毒素检查方法验证；凝胶法　［中图分类号】Ｒ９２７　［文献标识码】Ｂ　【文章编号】２０９５—０６１６（２０１４）２１—１０５—０３　Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈ０ｄ　ｏｆ　ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ　ｔａｒｔｒａｔｅ　Ｊ　Ｈａｉｃｈｅｎｇ　ＮＧ　ＯＵ　ＮＧ　Ｃｎｕｎｌｉｎｇ　ＬＩ　Ｘｉａｏｂｉ　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｈａｏｓｅｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｌｔｄ，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ　２２２０００，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ａｎｄ　ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ（ｇｅ１）ｏｆ　ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ　ｔａｒｔｒａｔｅ’　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｒｅｆｅｒ　ｔｏ　ＵＳＰ．ＥＰ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ“Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ”（２０１０　Ｅｄｉｔｉｏｎ）ｔｗｏ　ａｐｐｅｎｄｉｘ　ＸＩＥ’ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ　ｔａｒｔｒａｔｅ’　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｌｉｍｉｔ　ｖａｌｕｅｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　Ｌ＜２．０ＩＵ／ｍｇ　ｆｔａｋｅｎ　Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ　ｍｅｔｅｒ），ａｎｄ　ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｙ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，ｎｏ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　０．０３５ｍｇ／ｍＬ（ｔａｋｅｎ　Ｃｈａｎｇｅｈｕｎ　ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ　ｍｅｔｅｒ）．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｗｅ　ｃａｎ　ｍａｋｅ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｔｅｓｔ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｉｓ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｂｙ　ａｄｏｐｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｄｕｃｔ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ　ｔａｒｔｒａｔｅ；Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ；Ｇｅｌ　ｍｅｔｈｏｄ　酒石酸长春瑞滨（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ　ｔａｒｔｒａｔｅ）化学名　３’。４’一二去氢一４’一去氧一８’一去甲长春碱二酒　石酸盐，属于长春碱类抑制细胞分裂的抗肿瘤药　物，主要通过抑制微管蛋白的聚合，使细胞分裂停　止于有丝分裂中期…，是一细胞周期特异性的药物。　临床上主要与其他抗癌药物联合应用于治疗非小细　胞肺癌，也可用于晚期乳腺癌［２－５１、食管癌等。ＦＤＡ　于１９９４年批准酒石酸长春瑞滨用于晚期非小细胞　肺癌患者的一线治疗。无菌检查、细菌内毒素检查、　微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目［６１。　本品制剂为酒石酸长春瑞滨注射液，其国内现　行标准为《中国药典》，明确规定了细菌内毒素检查　的项目与标准【　。酒石酸长春瑞滨目前国内现行　标准为《中国药典》，现标准中未规定细菌内毒素的　控制项目与标准Ｌ７ｊ。为更好地控制制剂的细菌内毒　素水平，对酒石酸长春瑞滨原料开展建立细菌内毒　素检查标准与方法的研究，参照《中国药典》（２０１０　年版）二部附录Ⅺｘ　Ｍ化学药品注射剂安全Ｉ生检查法　应用指导原则及附录ⅪＥ细菌内毒素检查法［７］、ＵＳＰ　（８５）ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ　ＥＮＤＯＴＯＸＩＮ　ＴＥＳＴｍ］、ＥＰ（２．１．６．４）　ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ　ＥＮＤＯＴＯＸＩＮ　ＴＥＳＴ［９１以及ＥＰ８．０中酒　石酸长春瑞滨细菌内毒素标准【　ｍ、ＵＳＰ３７一ＮＦ３２中　酒石酸长春瑞滨注射液的细菌内毒素标准ｌｌ１】，建立　并验证本品种的细菌内毒素检查标准与方法。　１　实验材料　１．１仪器　电子分析天平、ＤＨＧ一９１４６Ａ型电热恒温鼓风　干燥箱、ＸＷ一８０Ａ旋涡混合器、ＤＫ一６００电热恒温水　槽、ＨＨ一２Ｆ净化工作台。　１．２试剂　１．２．１　细菌内毒素工作标准品　规格１６０ＥＵ／支，　批号１５０６０１—２０１１７４，中国药品生物制品检定所。　１．２．２　鲎试剂　鲎试剂１（入＝Ｏ．０３ＥＵ／ｍＬ，规格　０．１ｍＬ／支，批号１２１１０２２，湛江安度斯生物有限公　司）；鲎试剂２（　＝０．０３ＥＵ／ｍＬ，规格０．ｉｍＬ／支，批　号１２０６０６１２，福州新北生化工业有限公司）。　１．２．３细菌内毒素检查用水ＷＢＥＴ规格５０ｍＬ／瓶，　批号１３０２０３１５，福州新北生化工业有限公司。　１．２．４　碱性ｐＨ调节剂　规格２ｍＬ／支，批号　１２１　１２７，福州新北生化工业有限公司。　１．２．５酒石酸长春瑞滨批号：１３０７０１、１３０７０２、　１３０９０１　ＣＨＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＰＨＡＲＭＡＣＹ　Ｖｏ１．４　Ｎｏ．２１　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１　４

细菌内毒素检验方法验证方案

一、背景介绍

细菌内毒素是一种由细菌产生的有毒分子，它可以引起中毒反应并对人类健康造成危害。因此，准确检测和验证细菌内毒素的方法非常重要。本方案旨在验证细菌内毒素检验方法的准确性和可靠性。

二、实验目的

本实验旨在验证细菌内毒素检验方法，确保其能够准确地检测细菌内毒素的含量。

三、实验材料和设备

1. 细菌内毒素检验试剂盒

2. 细菌培养基

3. 细菌菌种

4. 培养皿

5. 恒温培养箱

6. 试管

7. 离心机

8. 显微镜

9. 无菌培养室 四、实验步骤

1. 准备工作

a. 清洁实验桌面和实验器材，防止污染。

b. 准备所需要的材料和设备，并确保其干净和无菌。

2. 细菌培养

a. 随机取一支细菌菌种采样放入培养基中并均匀涂抹于培养皿上。

b. 将培养皿置于恒温培养箱中，以适当的温度和时间培养细菌。

3. 细菌内毒素检验

a. 取一份细菌内毒素检验试剂盒，根据说明书的指导进行试剂的调配和处理。

b. 等待试剂反应完成后，根据试剂盒的说明书进行结果的解读。

4. 结果分析

a. 观察试剂盒结果，根据颜色变化和强度判断细菌内毒素的含量。

b. 结果符合预期的样本被认为是阳性，否则为阴性。

五、质量控制

1. 测量前需进行必要的质量控制，包括试剂的稳定性和标准品的准确性。

六、风险控制 1. 实验过程中需佩戴个人防护装备，如实验手套和口罩，以减少潜在的健康风险。

七、数据处理与结果

1. 将实验所得数据进行整理和统计，并进行数据分析和结果的解读。

八、讨论与结论

1. 讨论实验结果与预期结果之间的差异，分析可能的原因，并提出改进和优化的建议。

2. 结论验证细菌内毒素检验方法的准确性和可靠性。

九、参考文献

参考实验所使用的细菌内毒素检验方法的相关文献。

以上是细菌内毒素检验方法验证方案的内容，该方案通过详细的步骤和操作说明，确保了实验的准确性和可靠性。通过验证该方法，将可为细菌内毒素检验提供可靠的数据支持，为相关领域的研究和应用提供技术支持。

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丹曲林钠细菌内毒素测定方法学验证

作者：陈伟娜 陈嘉璐 曾华哲 王燕清

来源：《中国医药科学》2017年第03期

[摘要]目的通过检验、控制丹曲林钠原料药的内毒素水平以期控制注射用丹曲林钠的内毒素限值，因此需要建立丹曲林钠原料药的细菌内毒素验证方法。方法用DMF溶解丹曲林钠至0.12mg/mL，以灵敏度为0.06EU/mL的两个厂家的鲎试剂，按照内毒素检测方法进行了鲎试剂灵敏度复核实验、溶剂干扰试验、样品干扰试验等方法学验证实验。结果两个厂家鲎试剂的入c均为0.06EU/mL，在0.5～2入之内；采用上述方法进行验证，溶剂及样品均无干扰。结论丹曲林钠原料内毒素验证需要DMF溶解样品，按照最低稀释浓度要求配制的供试品对内毒素的检测也没有干扰，因此可以判定可用该方法对本品进行内毒素检查。

[关键词]丹曲林钠；细菌内毒素；方法学验证；DMF

[中图分类号]R927

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616（2017）03-53-04

丹曲林钠的商品名为Dantrium，是美国保洁（P&G）公司研制的药物，于1979年被美国FDA批准上市。丹曲林钠用于治疗恶性高热。恶性高热（malignant hyperthermia，MH）是一种严重的骨骼肌肉代谢亢进综合征，是一种常染色体显性遗传性疾病。MH的发生主要是基于骨骼肌细胞内迅速且不可控的ca2+浓度增加，进而产生致死性的代谢亢进危象，在没有特异性治疗药物的情况下，一般的临床降温措施难以控制体温的增高，最终可导致患者死亡。据报道，在接受全身麻醉的患者中MH发生率在1：10000到1：250000，且各地发生率各有差异。有丹麦研究称MH发病率在1：250000，纽约的一项研究称MH发病率在1：100000，同时，另一项法国的研究发现全身麻醉中MH发生率可达1：10000，而且他们发现利用基因检测的方法预估其发病率应该在1：2000到1：3000之间。近来，有研究称携带MH相关治病基因的几率可高达1：400。丹曲林钠是特异性RYRl受体拮抗剂，是目前公认的治疗MH发作的特效药，它能够关闭RYRl受体的异常开放，迅速减少肌质网释放Ca2+，从而终止MH发作。其具体作用位点尚不明确，有研究称可通过改变RYRl与DHPR间的联系从而抑制DHPR通道，或者通过与RPRl特异性位点结合而抑制该通道。丹曲林钠自1979年使用以来，MH的死亡率大大降低，从80%降低至不足10%。有研究称在MH发生早期（30min内）使用丹曲林钠，其死亡率有明显降低。

第 1 页 共 8 页 GMP管理文件

题 目 细菌内毒素检查操作规程

制 定 审 核 批 准

制定日期 审核日期 批准日期

颁发部门 GMP办 颁发数量 2 生效日期

分发部门 质量管理部、综合办公室

一、 引用标准：中华人民共和国S药典（2005年版）一部。

二、 目 的：本标准规定了细菌内毒素检查法标准操作规程。

三、 适用范围：适用于细菌内素毒素的检查。

四、 责 任 者：质检人员。

五、 正 文：

1、简述 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以供试吕中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。

细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

细菌内毒素工作标准系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量含量小于

第 2 页 共 8 页 0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。

试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。

供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，何使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。