生物药物分析实验课讲义
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实验 胃蛋白酶片的测定
实验目的：掌握以胃蛋白酶测定法测定胃蛋白酶片中胃蛋白酶的效价。
实验原理：精密称取本品适量，加盐酸溶液制成每1mL中约含0.2-0.4个单位的溶液，照胃蛋白酶测定法，测定胃蛋白酶的效价。
实验部分：
1.材料与设备
血红蛋白试液、三氟醋酸溶液、盐酸溶液
紫外可见分光光度计
2.操作步骤
1）. 供试品溶液的制备
取本品5片，置研钵中，加盐酸溶液少许，研磨均匀，移至250mL量瓶中，加上述盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密称取适量，用上述盐酸溶液稀释制成每1mL中约含0.2-0.4个单位的溶液，作为供试品溶液。
2）. 对照品溶液的制备
精密称取酪氨酸对照品适量，加盐酸溶液稀释制成每1mL中约含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
3）供试品的测定
取大小相同的试管6支，其中3支精密加入对照品溶液1mL，另3支精密加入供试品溶液1mL，置37℃±0.5℃水浴中，保温5分钟，精密加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5mL，摇匀，并准确计时，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟，立即精密加入5%三氟醋酸溶液5mL，摇匀，滤过，取续滤液备用。另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5mL，置37℃±0.5℃水浴中保温10分钟，再精密加入5%三氟醋酸溶液5mL，其中一支加供试品溶液1mL，另一支加上述盐酸溶液1mL，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照紫外-可见分光光度法，在275nm的波长处测定吸光度，按下列公式计算，即得。
注意事项：
思考题：
实验 三磷酸腺苷二钠片总核苷酸含量测定
实验目的：掌握以胃蛋白酶测定法测定胃蛋白酶片中胃蛋白酶的效价。
实验原理：精密称取本品适量，加盐酸溶液制成每1mL中约含0.2-0.4个单位的溶液，照胃蛋白酶测定法，测定胃蛋白酶的效价。
实验部分：
1.材料与设备
血红蛋白试液、三氟醋酸溶液、盐酸溶液
紫外可见分光光度计
2.操作步骤
1）. 供试品溶液的制备
取本品5片，置研钵中，加盐酸溶液少许，研磨均匀，移至250mL量瓶中，加上述盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密称取适量，用上述盐酸溶液稀释制成每1mL中约含0.2-0.4个单位的溶液，作为供试品溶液。
2）. 对照品溶液的制备
精密称取酪氨酸对照品适量，加盐酸溶液稀释制成每1mL中约含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。 3）供试品的测定
取大小相同的试管6支，其中3支精密加入对照品溶液1mL，另3支精密加入供试品溶液1mL，置37℃±0.5℃水浴中，保温5分钟，精密加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5mL，摇匀，并准确计时，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟，立即精密加入5%三氟醋酸溶液5mL，摇匀，滤过，取续滤液备用。另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5mL，置37℃±0.5℃水浴中保温10分钟，再精密加入5%三氟醋酸溶液5mL，其中一支加供试品溶液1mL，另一支加上述盐酸溶液1mL，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照紫外-可见分光光度法，在275nm的波长处测定吸光度，按下列公式计算，即得。
注意事项：
思考题：
实验七 药物的一般杂质检查
一、实验目的：
1. 掌握药物的一般杂质检查原理与实验方法。
2. 熟悉一般杂质检查项目与意义。
二、实验原理：
药物的一般杂质：是指在自然界中分布较广泛，在多种药物的生产和贮藏过程中容易引入的杂质，如酸、碱、水分、氯化物、硫酸盐、砷盐、铁盐、重金属等。
1.比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比浊法是指测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法，本法主要是用于测定能形成悬浮体的沉淀物质。
a、酸碱度检查：是用药典规定的方法对药物中的酸度、碱度及酸碱度等酸碱性杂质进行检查。检查时应以新沸并放冷至室温的水为溶剂。不溶于水的药物，可用中性乙醇等有机溶剂溶解。常用的方法有酸碱滴定法，指示剂法以及pH值测定法。
b、氯化物检查法：氯化物在硝酸溶液中与硝酸银作用，生成氯化银沉淀而显白色浑浊，与一定量的标准氯化钠溶液和硝酸银在同样条件下用同法处理生成的氯化银浑浊程度相比较，测定供试品中氯化物的限量。
反应离子方程式：Cl- + Ag+ → AgCl↓（白色）
c、铁盐检查法：三价铁盐在硝酸酸性溶液中与硫氰酸盐生成红色可溶性的硫氰酸铁络离子，与一定量标准铁溶液用同法处理后进行比色。
反应离子方程式：Fe3+ + 3SCN- → Fe（SCN）3（红棕色）。
2.限量计算:杂质限量%=((V标准×C标准)/W样)×100%。式中V标准为标准液体积，C标准为标准液浓度，W样为样品取样量。
三、实验内容： 1.实验材料、设备：
葡萄糖、氯化钠原料药。
25ml、50mL纳氏比色管、刻度吸管、电子天平。
2.实验操作步骤：
（一）葡萄糖
1、酸度
取本品2.0g，加水20mL溶解后，加酚酞指示液3滴与氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）0.20mL，应显粉红色。
2、溶液的澄清度与颜色
取本品5g，加热水溶解后，放冷，用水稀释至10mL，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（附录H）比较，不得更浓；如显色，与对照液（取比色用氯化钴液3mL、比色用重铬酸钾液3mL与比色用硫酸铜液6mL，加水稀释成50mL）1.0mL加水稀释至10mL比较，不得更深。
3、乙醇溶液的澄清度
取本品1.0g，加90%乙醇30mL，置水浴上加热回流约10分钟，溶液应澄清。
4、氯化物
取本品0.6g，加水溶解使成25mL，再加稀硝酸10mL；溶液如不澄清，应滤过；置50mL纳氏比色管中，加水使成约40mL，摇匀，即得供试溶液。另取标准氯化钠溶液6.0mL，置50mL纳氏比色管中，加稀硝酸10mL，加水使成40mL，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0mL，用水稀释，使成50mL，摇匀，在暗处放置5分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较。供试溶液所显浑浊度不得较对照液更浓（0.01%）。
5、干燥失重
取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过9.5%。
6、硫酸盐
取本品2.0g，加水溶解使成约40mL；溶液如不澄清，应滤过；置50mL纳氏比色管中，加稀盐酸2mL，摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液2.0mL，置50mL纳氏比色管中，加水使成约40mL，加稀盐酸2mL，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%氯化钡溶液5mL，用水稀释至50mL，充分摇匀，放置10分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较。供试溶液所显浑浊度不得较对照液更浓（0.01%）。
7、亚硫酸盐与可溶性淀粉
取本品1.0g，加水10mL溶解后，加碘试液1滴，应即显黄色。
8、铁盐
取本品2.0g，加水20mL溶解后，加硝酸3滴，缓缓煮沸5分钟，放冷，加水稀释使成45mL，加硫氰酸铵溶液（30→100）3mL，摇匀，如显色，与标准铁溶液2.0mL用同一方法制成的对照液比较，不得更深（0.001%）。
9、 蛋白质 取本品 1.0g，加水 10ml 溶解后，加磺基水杨酸溶液（1→5）3ml，不得发生沉淀。
（二）氯化钠杂质检查
1、溶液的澄清度
取本品5.0g，加水25ml溶解后，溶液应澄清。
2、碘化物
取本品的细粉5.0g，置瓷蒸发皿内，滴加新配制的淀粉混合液适量使晶粉湿润，置日光下（或日光灯下）观察，5分钟内晶粒不得显蓝色痕迹。
3、硫酸盐
取本品5.0g，加水溶解成约40ml（溶解如显碱性，可滴加盐酸使成中性），溶液如不澄清，应滤过，置50ml纳氏比色管中，加稀盐酸2ml，摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液1.0ml置50ml纳氏比色管中，加水使成约40ml，加稀盐酸2ml，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%氯化钡溶液5ml，用水稀释使成50ml，充分摇匀，放置10分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，供试品管不得更浓（0.002%）。
4、钡盐
取本品4.0g，加水20ml，溶解后，滤过，滤液分为两等份，1份中加稀硫酸2ml，另一份中加水2ml，静置15分钟，两液应同样澄清。
四、实验注意事项：
1、比色管的正确使用——选择配对的两支纳氏比色管，用清洁液荡洗除去污物，再用水冲洗干净。采用旋摇的方法使管内液体混合均匀。
2、平行操作——标准与样品必须同时进行实验，加入试剂量等均应一致。观察时，两管受光照的程度应一致，使光线从正面照入，比色时置白色背景上，比浊时置黑色背景上，自上而下地观察。
五、思考题
4.1 中国药典（2000 年版）在葡萄糖杂质检查中规定检查十二项，是根据什么原则制订的？目的何在？
4.2 重金属与砷盐检查的原理是什么？如何计算其限量？
5 参考文献
5.1 葡萄糖：《中国药典（2000 年版）》二部，第 815 页
实验 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）
一、实验目的
掌握比色法测定过氧化物酶活性的原理和操作方法
二、实验原理
过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。
三、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：小麦叶片
（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。
（三）试剂：10%H2SO4；0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；0.1mol/L 高锰酸钾标准液(称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定)；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。
三、实验步骤
（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。
