维生素的检测方法

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食品中维生素B12的检测方法分析

作者：何嘉明

来源：《现代食品·下》2019年第05期

摘要：功能性食品、婴幼儿配方乳粉等食品中添加的维生素B12，一般采用微生物比浊法或者高效液相色谱法检测，检测难度较大。本文归纳了国家标准和AOAC的检测方法，探讨GB 5413.14-2010检测的注意事项，关注试剂盒与国家标准法的效果对比。

关键词：维生素B12;检测方法;试剂盒;国家标准

中图分类号：11155.5

1维生素B12的性状、功能和摄入推荐量

维生素B12又名钴胺素，是一类含钴的咕啉类化合物的总称，维生素B12分子中的钴能和-CN、-OH、-CH3或5-脱氧腺苷等基团相连，形成羟基钴胺素（Hydroxycobalamin）、氰基钴胺素（Cyanocobalamin）、脱氧腺苷钴胺素（Deoxyadeno sylcobalamin）和甲基钴胺素（Methylcobalamin）。其中甲基钴胺参与体内甲基移换反应和叶酸代谢，是N5-甲基四氢叶酶甲基移换酶的辅酶。5-脱氧腺苷钴胺是甲基丙二酰辅酶A变位酶的辅酶，参与体内丙酸的代谢。

维生素B12缺乏可引起贫血、高同型半胱氨酸血症、神经精神疾病、生育与出生缺陷等。在新生儿期，维生素B12：缺乏可严重损害神经系统的发育和功能，婴儿多表现为生长迟缓和神经系统的缺陷。婴儿一旦发生维生素B12缺乏，维生素B12的低水平将会至少持续1年。维生素B12缺乏的常见原因可有：①摄入不足。②获得性吸收不良，如胰源性、胃源性、肝源性或肠源性疾病等。③对维生素B12需求量增加，如妊娠、产后、绦虫病等。④先天性维生素B12代谢步骤的障碍。⑤药源性缺乏。

《中国居民膳食营养素参考摄入量》中推荐的维生素B12摄入量：14岁以上人群为2.4ug·d-1，1-14岁人群需控制在1.0-24ug·d-1，并随年龄增长;1岁以下为适宜摄入量，半岁前为0.3ug·d-1，半岁后为0.6ug·d-1。2维生素B12测定方法

维生素A的测定方法

维生素A的测定方法 比色法

1.原理

维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该蓝色物质虽不稳定，但在一定时间内可用分光光度计于620nm波长处测定其吸光度。

2.仪器

实验室常用设备 分光光度计 回流冷凝装置

3.试剂

本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水

（1） 无水硫酸钠 Na2SO4

（2） 乙酸酐

（3） 乙醚 不含有过氧化物

（4） 无水乙醇 不含有醛类物质

（5） 三氯甲烷 应不含分解物，否则会破坏维生素A

检查方法：三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢和光气。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水振摇，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银溶液，如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物。

（1） 25%三氯化锑-三氯甲烷溶液 用三氯甲烷配制25%三氯化锑溶液，储于棕色瓶中（注意避免吸收水分）

（6） 50%氢氧化钾溶液（KOH） W/V

（7） 维生素A标准液 视黄醇（纯度85% Sigma）用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。

（8） 酚酞指示剂 用95%乙醇配制1%溶液

4. 操作步骤

维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行。

4.1样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。

(1)皂化法：

皂化：根据样品中维生素A含量的不同，称取0.5g～5g样品于三角瓶中，加入20～40ml无水乙醇及10ml1：1氢氧化钾，于电热板上回流30min至皂化完全为止。（皂化法适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部实验过程费时，且易导致维生素A 损失）

提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以30ml水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣子，可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内。用50ml乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30ml乙醚分二次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止。

食品中维生素C的检测方法

维生素C是机体正常生命活动所必需的有机化合物，作为一种理想的保健食品功能因子，被添加于各种保健食品及饮料中，因此对维生素C含量测定方法的研究也较多。目前常规的维生素C含量测定方法有紫外分光光度法、碘量法等，但是维生素C具有较强的还原性，在中性和碱性环境下不稳定，遇热迅速分解，检测方法操作步骤复杂，具有试剂和试样溶液不稳定、灵敏度低、费时等缺点，尤其是有颜色的试样，其溶液颜色背景干扰大，对最终数据有影响。

高效液相色谱法具有高效、快速、稳定、灵敏度高的特点，能在较短时间内完成测定。

一、实验目的和要求

1、学习高效液相色谱外标法定量定性分析方法；

2、熟悉高效液相色谱的分析操作规程；

3、学习高效液相色谱检测食品中的维生素C的方法。

二、实验原理

在以维生素C标准品保留时间定性，采用外标法定量维生素C含量。

X=(A2×C)/A1

（X为样品中维生素C的含量单位为ug/mL，单位；A1为标样维生素C的峰面积；A2为样品中维生素C峰面积；C为维生素C标准液质量浓度。）

三、仪器、试剂

1、仪器：岛津高效液相色谱仪、超声波清洗仪、超纯水制备仪、千分之一天平、离心机

2、试剂：维生素C标准品、醋酸、超纯水、橙汁

四、实验步骤

1、标准液的制备：

维生素C标准溶液配制:准确称取0.1219g维生素C，用0.1%醋酸溶液溶解，超声波振荡5min，再用0.1%醋酸定容至50mL，为标准溶液。分别吸取标准溶液0.05，0.10，0.50，1.00，2.00，3.00mL于10mL容量瓶中，用0.1%醋酸溶液定容，进样测定。

2、样品的前处理： 试样处理试样为液体时，吸取适量体积试样原液用20mL0.5%醋酸溶液作为稀释液，再用水定容至100mL;试样为固体时，称取试样1g用0.1%醋酸溶液溶解(按照试样液中维生素C含量0.5~700mg/L换算)，超声波振荡5min，再用0.1%醋酸定容至100mL，过滤，用0.45m滤膜过滤，进样。

９８　Ｉ｝　Ｈ　ｇｄｃｈｅｍ．ｃｏｍ　２０１０年第７期　第３７卷总第２０７期　蔬果中维生素Ｃ含量的检测方法　谷雪贤　（中山火炬职业技术学院生物医药系，广东中山５２８４３６）　【摘要】蔬菜、水果中维生素ｃ的测定方法有很多，如间接原子吸收分光光度法、分光光度法、高效液相色谱法等，各种方法各有特点。文章　对近年来有关维生索ｃ的测定方法进行了综述。　【关键词】维生素ｃ；原子吸收分光光度法；紫外光度分析法；高效液相色谱法；蔬菜、水果　【中图分类号］０６５　［文献标ｉＲ￣］Ａ　［文章编￣－］１００７—１８６５（２０１０）０７－００９８—０１　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｃ　ｉｎ　Ｆｒｕｉｔｓ　ａｎｄ　Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ　Ｇｕ　Ｘｕｅｘｉａｎ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ　Ｔｏｒｃｈ　Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ，Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ　５２８４３６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍａｎｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｗａｙｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｃ　ｉｎ　Ｆｒｕｉｔｓ　ａｎｄ　ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｒｅｐｏｓｅｄ．ｆｏｒ　ｅｘａｍｐｌｅ　ＵＶ—Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ，ＨＰＬＣ　ｅｔｃ　Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｔ、ｖｉｔａｍｉｎ　Ｃ　ｗｅｒｅ　ｒｅｖｉｅｗｅｄ　ｉｎ　ｒｅｃｅｎｔ　ｙｅａｒｓ　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｖｉｔａｍｉｌｌ　Ｃ；ａｔｏｍｉｃ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔ￣＇；ＵＶ—Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ；ＨＰＬＣ；ｆｒｕｉｔ；ｖｅｇｅｔａｂｌｅ　维生素Ｃ又叫抗坏血酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃｉｄ），广泛存在于植物组织　中，新鲜的水果、蔬菜中含量较多。是一种水溶性小分子生物　活性物质，也是人体需要量最大的一种维生素。维生素Ｃ具有　还原性（其结构式如图１），可以与许多氧化剂发生氧化还原反　应，因此可以利用其还原性测定维生素Ｃ的含量。目前食品中　测定维生素Ｃ含量的方法主要有碘量法０　Ｉ，是利用维生素Ｃ的　氧化还原性为基础的一种氧化还原方法。冈其酸度不易把握，　碘需要标定且易挥发，而Ｖｃ不易稳定保存，使测定结果易出　现偏差，且这种方法不适合微量分析；国标ＧＢ，Ｔ６　１　９５—１　９８６是　采用２，６一二氯靛酚滴定法　Ｊ。利用样品溶液由蓝色转变为粉红　色来辨别其滴定终点的到达。但是多数水果、蔬菜样品其提取　液都具有一定的色泽而导致滴定终点不明显，使测定准确度降　低。另外还有荧光光谱分析法　Ｊ、紫外一可见分光度法、色谱　法、电化学法等，这些方法都存在着一定的局限性，如操作过　程复杂，所用试剂不稳定，速度慢、背景¨ｒ扰大。　近年来，建立的测定Ｖｃ的其他方法还有催化动力学和光　度法相结合的方法，及ＶＣ传感器测定方法，固定ｐＨ滴定法等。　该论文将对蔬菜、水果常用的维生素Ｃ含量的检测方法进行综　述、比较。　０Ｈ　Ｈ　０Ｈ　０Ｈ０　ＣＨ，一ＣＨ—Ｃ—Ｃ—Ｃ—Ｃ　０Ｈ　ｕ　图１　维生素Ｃ的结构式　Ｆｉｇ．１　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｃ　１原子吸收分光光度法　利用原子吸收分光光度法问接测定维生素Ｃ的含量，是利　用维生素Ｃ可以与一些金属离子发生氧化还原反应，通过测定　反应掉的金属离子的量，进而间接计算出维生素ｃ的含量。　１．１以银离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法　以银离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法，是利用　维生素Ｃ分子中的有二烯醇基具强还原性，可被硝酸银氧化　为去氢维生素Ｃ，同时产生黑色银沉淀（反应式如罔２）。　Ｈ　图２　Ｆｉｇ．２　维生素Ｃ与银离子反应的反应式　沉淀经离心分离后，将分离得到的沉淀用硝酸溶解后，再　利用原子吸收分光光度计测定银离子的含量，从而接测得维生　素Ｃ含量，具体测定方法如下：　配制一系列浓度的维生素Ｃ标准溶液，依次吸取一定量的维　生素Ｃ标准溶液置于ｉＯ　ｍＬ离心管中，分别加入２　ｍＬ　１　ｍｇ／ｍＬ　Ａ　标准溶液，然后加水使总体积为４　ｍＬ，摇匀，在室温下避光放置　３５　ｍｉｎ离心分离弃去上清液，用２Ⅱ１Ｌ超纯水洗涤沉淀３次，然后　用ｌ：１的浓硝酸３　ｍＬ溶解沉淀，移人５０ｌｎＬＪ的容量瓶中，加水稀　释至刻度。喷入空气一乙炔火焰分别测定其吸光度，以维生素Ｃ　标准溶液的浓度为横坐标，以测得的吸光度值为纵坐标绘制标准　曲线。最后将处理过的待测样按上述方法测定其维生素Ｃ含量。　上述方法巾维生素Ｃ标准溶液及样品的配制都是利用２％　的柠檬酸作为溶剂，并在棕色瓶中保存，原因是维生素Ｃ在溶　液中不稳定，遇氧气、光、热、碱性物质易受破坏，而在适当　的酸性条件下比较稳定，用２％的柠檬酸溶液来配制维生素Ｃ　标准溶液，减缓了维生素Ｃ被氧化的速度，同时消除了一定外　界因素的十扰，使得测定结果比较稳定［４ｊ。　１．２以铜离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法　文献中报道了以铜离子作为氧化剂的间接原子吸收分光　光度法。该方法也是利用维生素Ｃ在酸性介质中维生素Ｃ可　将Ｃｕ　定量的还原为Ｃｕ　，然后Ｃｕ　与ＳＣＮ一反应生成ＣｕＳＣＮ　沉淀，在高速离心机下有效地分离出ＣｕＳＣＮ沉淀，洗涤后再　经浓硝酸溶解，用原子吸收法测定沉淀中的含铜量，即可推知　样品中维生素Ｃ的含量。具体测定方法如下：　分别吸取１　ｍＬ配制的含一定量维生素Ｃ的标准溶液（随配　随用）（分别含维生素Ｃ　５０、１００、２００、３００、４００、５００　ｇｇ）和样　品提取液，依次放置于已编号的ｌ５　ｍＬ离心管中，各加入１　ｍＬ　ＣｕＳＯ４饱和溶液、１　ｍＬ浓度为２％硫氰酸铵溶液、Ｏ．５　ｍＬ盐酸一　醋酸钠缓冲液和０．５　ｍＬ饱和ＮａＣ　１溶液充分混和，稍后离心分　离，弃去上层清液，小心地用少量水洗涤沉淀２～３次（注意每　次用水不能超过１　ｍＬ），加入０．５　ｍＬ．ｆｉ￣ｊ酸溶解后，转移至ｌＯ０ｍＬ　的容量瓶中加水定容至刻度线，摇匀。分别用原子吸收分光光　度计测定其含铜量，由所得的维生素Ｃ含量的标准曲线，可以　得到相应样品的试验结果。　该方法所得的试验结果相对标准偏差ＲＳＤ在５％以内加标回　收率在９６．５６％～１００．６７％，其精密度和准确度均达到痕量分析要　求。此方法的线性相关系数尺＝Ｏ　９９８９，表明相关性很好　Ｊ。　２紫外可见分光光度法　利用紫外分光光度法测定维生素Ｃ的含量是基于维生素ｃ在　紫外光区有特征吸收，但是因为维生素Ｃ结构中具有不饱和键，　具有还原性，不易稳定存在，直接测定误差较大。所以在利用紫　外分光光度法测定时，维生素标准溶液和待测样的配制条件非常　重要。　［收稿Ｅｔ期】２０１０—０３—３　１　［作者简介］谷雪贤（１９７９一），女，河北邢台人，讲师，　＃要研究方向为精细化学品的合成及分析　（下转第１０６页）