最新生物化学 第2章 蛋白质(2)演示教学

活性染色：
根据有活性的目标蛋白质特有的生物化学反应 产生的有色物质或另外加入某种能与产物生成颜色 的物质来进行检测的.活性染色可以从一个复杂的蛋 白质样品中检测到目标蛋白出现的位置。活性染色 法在同工酶(例如酯酶同工酶、谷氨酸脱氢酶同工酶、 谷氨酰胺合成酶同工酶等)的检测中非常有用。
免疫印迹(Immunoblotting)或蛋白质印迹 (Western blotting)是检测目标蛋白质的一项十分 有效的方法。一种蛋白质(抗原)能与它产生的抗体专 一地反应。在电泳之后,欲检测目标蛋白的存在,可以 先将凝胶中的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上,然后 用目标蛋白产生的抗体与之产生抗原-抗体反应,最后 可用连接有碱性磷酸酯酶或辣根过氧化酶的第二抗体 (通用抗体)与第一抗体反应,加入能与抗体共接的酶 反应生成有色物质的生色液,即可十分可靠地检到的 目标蛋白。
七 蛋白质的沉降作用及超离心分离
沉降速度(ν = dx / dt )与蛋白质分子的大小和密 度有关。
沉降速度法，适用于分离沉降系数不同但密度相近 的蛋白质。
沉降平衡法，适用于沉降系数相近，但密度不同 的蛋白质。
沉降系数：当沉降界面以恒定的速度移动时，单 位离心场里的沉降速度。
用离心法分离细胞亚微结构
600g,3 min.上清
沉淀：细胞核
6000g,8 min.上清
沉淀：线粒体，叶绿体， 溶酶体，过氧化酶体
沉淀：细胞质膜，高尔基 体和内质网膜的碎片
40000g.30 min.上 清
100000g.90 min.上清
沉淀：核糖体亚基
细胞液
平衡密度梯度离心：
用不同的离心速度、依据被分离物的密度而进 行分离的效果；通常是将没有纯化的物质铺在密度 溶液（如蔗糖溶液，氯化铯溶液为介质，离心管内 的溶液密度从底部到顶部是浓至稀的梯度）的顶层， 通过离心（160000g，3h）细胞内各成分不停地 下沉分别达到与溶液的密度相等时的位置。其介质 的密度范围宽于被分离组分的密度。
（一） 氨基酸的组成分析 蛋白质在标准条件下经酸水解后, 进行氨基酸的组成
分析.通过组成分析基本上可推测出部分水解所产生的肽 碎片的数目。
（二）末端分析(确定蛋白质的肽链组成) ：通常测定肽链 的N-末端. 二硝基氟苯(DNFB)法 或丹磺酰氯（DNSCl）法是常用的方法。丹磺酰氯为一种更有效的试剂， 灵敏度比DNFB法高100倍。
丹磺酰氯分析多 肽链的N－末端
苯异硫氰酸 酯（PITC） Edman试 剂
水解多 肽确定 基酸 组成
确定N末端的 氨基酸残基
确定N末端的氨基酸残基 剩下的多肽可以再利用。
（三）拆开链间或链内的二硫键
（1) 还原法：用巯基乙醇(HSCH2CH2OH)或二硫 苏糖醇等还原性试剂使二硫键打开，还原生成-SH。
目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:
1 材料的选择； 2 组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； 3 蛋白质初步提纯； 4 选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化； 5 目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质 的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白 酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特 定的折叠结构受到破坏。
（2)氧化法：常用过甲酸(CHOOOH)作为氧化剂， 使二硫键氧生成半胱氨磺酸(磺基丙氨酸残基) 。
（四）肽链的部分水解 常用胰蛋白酶法, 胰凝乳蛋白酶法和溴化氰法等方法。下面是
一个典型的多肽，用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 (糜蛋白酶)和溴化氰 分别处理所得到的结果：
差异（速）离心：用不同的离心速度、依据被
分离物的大小而将细胞亚结构彼此分离的效果。
速度区带离心：将样品铺在稀的蔗糖溶液的顶
层，溶液不用于分离而用以抗对流作用，离心完成 后，细胞各成分以其大小不同而在离心管中呈区带 分布，若离心时间太长，或离心力过大，细胞各成 分都会沉降至管底，而达不到分离效果。
差异（速）离心法
（五）电泳后的蛋白质检测：
考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据考 马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。 对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的分 离情况；如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋白质 的色带切下之后进行脱色,测定脱色液光吸收值,能对该蛋 白质进行定量分析。
三级结构（tertiary structure）：多肽 链在二级结构基础上进一步卷曲折叠，即整 个肽链（亚基）的空间形状。三级结构指的 是处于充分折叠、具有生物学活性的一个完 整的球蛋白的三维结构， 。
四级结构（quaternary structure）：寡 聚蛋白质分子亚基之间的相互关系和空间位 置。
二 蛋白质一级结构测定
蛋白质测序的一般步骤：
首先目标蛋白质分离纯化得到高度纯净的蛋白质样 品。
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目，末端分析， 分析多肽链的N末端和C末端。
（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。断裂链内二硫键。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成，酸水解或碱水解。 （4） 多肽链部分裂解成肽段，专一性酶解。 （5） 测定各个肽段的氨基酸顺序。 （6） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （7） 确定多肽链中二硫键的位置。
生物化学 第2章 蛋白质(2)
（四） 毛细管电泳
毛细管电泳技术是将养品点在装有凝胶的、 直径为20-75 μm 内经的毛细管里，进行电泳。 优点是分辨率高、、样品需要量小。电泳速度 快、上样和分离物的检测都能够进行自动化操 作。因为毛细管散热性能好，允许使用很高的 电压进行电泳。
除分离检测蛋白质外，在核酸的序列分析中 使用较为普遍。
差异（速）离心与平衡密度梯度离心法
第五节 蛋白质的一级结构和测定
（一）蛋白质一级结构概述
蛋白质的结构层次：
一级结构(primary structure)：多肽链内氨基酸残基从N端到 C端的排列顺序，或称氨基酸序列。
二级结构（secondary structure）：多肽链主链不同肽段沿主 轴盘旋折叠而形成的空间结构。二级结构是蛋白质结构的构象单 元。主要有α螺旋、β折叠、β转角、无规卷曲。