实验步骤（以处理小鼠血清样品为例）：通用版
血清处理：将收集的小鼠血液样品室温静置 40min~1h 后（不要超过 1h），放在冰上待处理（不要超过 4h），或者及时离心处理。静置待血液析出血清后，
3000rpm （1000g）， 4℃，10min 离心，离心后应呈现上层为无色或淡黄色透明血清，下层为凝集的红色血团。若上层血清呈现淡粉色或红色，则表示该血液样本溶血，血清颜色越深则表示溶血程度越高。吸取血清时若不小心吸到下层红色部分，则沿壁缓慢打回原 EP 管，过度机械损伤会造成溶血。用 1.5mlEP 管，可按吸出的血清量加入等体积的 0.1M 的盐酸，即样品中 HCl 的终浓度为0.05M。若血清量很大，则最好按实验需要分装成小管，避免血清反复冻融，然后冻存于-80℃备用。若做 Elisa 实验，则取出所需要量的血清，待融化后再 1:1 加入等体积的 0.05M 的 HCl，既将血清稀释了 4 倍，HCl 的终浓度仍然为 0.05M，混匀后低速离心备用。
1. 取出整盒 ELISA kit（保存于 4℃冰箱）放在 37℃培养箱预热 0.5h 至常温，将摇床温度调至 31℃，转速为 150 转/min。
2. 用已灭菌的 MQ H2O，稀释 10XHRP wash buffer 至 1X。
3. 取出所需数量的 wells，放在 96 孔底板上，板上可用数字标记好行列，避免出错，准备纸巾，铺 8 层左右，比底板略大即可。1X HRP wash buffer 300ul/well，沿着孔壁缓慢加入，以免破坏杯底的抗体。加完后用手轻微震荡 5s，迅速翻转，将液体甩入水池，再在纸巾上拍打，不能太轻，也不能太用力，杯底朝上，尽量将杯内所有液体倒干净，如上重复洗 3 遍，保证每孔湿润。此后每次加入液体均沿着杯壁缓慢加入，移液枪枪头不可接触杯内液体。加入不同样品时要及时更换移液枪枪头，加入相同液体时，可从不同方向沿杯壁加入，避免污染原管液体。
elisa的原理
ELISA是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，全称为酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）。它主要基于抗原与抗体之间的特异性结合原理，通过测量样品中特定抗体或抗原的浓度来检测和诊断某些疾病或研究生物分子相互作用。下面将详细介绍ELISA的原理。
一、ELISA的基本步骤
ELISA实验通常包括以下步骤：
1.涂覆：将待检测抗原或抗体溶液加入到微孔板中，并在其中固定到微孔板表面上。
2.阻断：用一种无特异性的蛋白质（如牛血清白蛋白BSA）阻止未被固定在微孔板上的表面粘附位点。
3.加入样品：将待检测样品加入到微孔板中，使其与固定在表面上的抗原或抗体发生特异性结合。
4.洗涤：洗去未结合的样品成分以减少误差。
5.加入检测物：加入与待检测分子特异性结合的检测物（如酶标记的抗体或抗原）。
6.洗涤：再次洗去未结合的检测物以减少误差。
7.加入底物：加入与酶标记特异性反应的底物，使其发生化学反应。
8.反应停止：用一种化学剂停止底物的反应，以便读取结果。
9.读取结果：使用光度计等设备测量样品中产生的光学信号，根据信号强度计算出待检测分子的含量。
二、ELISA的原理
1.抗原与抗体特异性结合
ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性结合原理。在实验中，待检测分子（如蛋白质、DNA等）被固定在微孔板表面上，形成固相。然后加入待检测样品，其中包含可能与固相分子特异性结合的抗体或抗原。如果样品中存在目标分子，则它们将与固相分子发生特异性结合。
2.酶标记技术
为了检测样品中是否存在目标分子，需要引入一种能够产生可观察信号的“标记”技术。酶标记技术是一种常用的标记技术，它将酶与抗体或抗原结合，并通过底物反应产生可观察的信号。
在ELISA实验中，常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。这些酶可以与抗体或抗原特异性结合，并能够催化底物的反应生成可观察的信号。例如，HRP可以催化底物TMB（3,3′,5,5′-四甲基苯胺）氧化成蓝色产物，AP则可以催化底物pNPP（对硝基苯磷酸）水解成黄色产物。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
基本原理：
1.直接ELISA：直接将酶标记的抗体与待测样品中的抗原结合。该方法简单，适用于检测高浓度抗原，但不适用于低浓度抗原检测。
2.间接ELISA：先将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，随后再加入酶标记的二抗与该特异性抗体结合。该方法适用于特异性抗体较多的情况，能够提高检测灵敏度。
3.夹心ELISA：利用两种抗体分别与待测样品中的抗原结合，形成夹心复合物。酶标记抗体与第二个抗体结合的复合物逐渐积累，从而实现对目标分子的定量检测。
4.竞争ELISA：利用酶标记抗体与待测样品中的抗原竞争结合，根据酶标记物对底物的催化反应产生的信号强度来反映待测样品中抗原的浓度。
操作步骤：
1.酶标板涂布：取出96孔的酶标板，在每孔中加入特异性抗体，通常用于检测的是抗原，也可以是抗体。将酶标板在4°C下孵育数小时或过夜，使抗体吸附在孔壁上。
2.冲洗：倒掉孔内液，用PBS-T洗涤缓冲液冲洗3-4次，去除未结合的抗体。
3.阻断：加入阻断缓冲液如5％的牛血清白蛋白(BSA)或非脂乳粉，防止非特异性结合。
4.样品加入：加入待测样品、标准品或对照样品，使待测物质与固相抗体结合。 5.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的样品。
6.酶标记抗体：加入酶标记的二级抗体，即酶联检测剂。
7.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的酶标记抗体。
8.底物加入：加入底物，底物受到酶标记的物质的催化，会产生信号。
9.反应停止：加入反应停止液，终止底物的反应。
10.读取结果：通过酶催化底物反应的产物颜色的变化，利用酶标仪读取OD值，反映抗原或抗体的浓度。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
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ELISA方法的基本原理和操作步骤
基本原理
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay
ELISA）用于IgG定量测定的文章
使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法
这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面
并保持其免疫活性
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体
这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性
又保留酶的活性
在测定时
把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开
最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例
加入酶反应的底物后
底物被酶催化变为有色产物
产物的量与标本中受检物质的量直接相关
故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析 由于酶的催化频率很高
故可极大地地放大反应效果
从而使测定方法达到很高的敏感度
方法类型和操作步骤
ELISA可用于测定抗原
也可用于测定抗体
在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体
②酶标记的抗原或抗体
③酶作用的底物
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件
可设计出各种不同类型的检测方法
（一）双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法
操作步骤如下：
（1）将特异性抗体与固相载体连接
形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间
让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合
形成固相抗原复合物
洗涤除去其他未结合的物质
（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合
彻底洗涤未结合的酶标抗体
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关
