玉米赤霉烯酮检测原理

玉米赤霉烯酮ELISA快速检测试剂盒操作说明书

1、 简介

本试剂盒采用间接竞争酶联免疫吸附ELISA原理快速定量检测谷物、饲料中的玉米赤霉烯酮（ZearaLenone,ZEN）。

谷物/饲料的前处理包括：提取、过滤、稀释，处理时间大约为20-40分钟。

本试剂盒的检测限为：10 ppb；谷物/饲料中ZEN的回收率 ≥80%；批内、批间变异系数<15% 。

2、 试剂盒组成

A. 24/48/96孔ZEN酶标板: 3/6/12条×8孔

B. 20×浓缩洗涤液：25mL (用蒸馏水稀释20倍使用) 1瓶

C. ZEN抗体: 3/6/12mL 1瓶 (红盖)

D. 酶标二抗： 3/6/12 mL 1瓶 (绿盖)

E. 显色液：3/6/12 mL 1瓶 (蓝盖)

F. 终止液:3/6 mL 1瓶 (黄盖)

G. ZEN标准品:1.5/2mL/瓶（0、30、60、200、500ppb） 各1瓶

H. 操作说明书 1份

注意：标准品含有低浓度ZEN、终止液含2 N H2SO4，需小心取用；勿在有效期外使用本试剂盒。

3、 贮存条件与有效期

2-8℃避光贮存，忌0℃以下冻存，有效期见试剂盒内盖。

4、 样品处理程序

 实验准备：配制60%甲醇水溶液（v/v，60:40）和20%甲醇水溶液（v/v，20:80）。

注意：请精确配制上述溶液，以免影响检测的准确性。

第３５卷第２期２００６年３月卫生研究

ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＨＹＧＩＥＮＥＲＥＳＥＡＲＣＨＶ０１．３５Ｎｏ．２Ｍａｒ．２００６２２ｌ

文章编号：１０００—８０２０（２００６）０２—０２２１．０４

玉米赤霉烯酮ＥＬＩＳＡ定量检测试剂盒研制

王玉平计融１江涛康维钧２杨福江３

中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京１０００２１・实验研究・

摘要：目的研制玉米赤霉烯酮ＥＬＩＳＡ快速定量检测试剂盒，用以检测食品中抗玉米赤霉烯酮（ＺＥＮ）。

方法在ＺＥＮ单克隆抗体基础上。用间接竞争酶联免疫吸附法研究试剂盒的各项指标。结果试剂盒最低

检出浓度为ｌｎｇ／ｍｌ，标准曲线的线性范围为１—２００ｎｇ／ｍｌ，回归方程为Ｐ＝０．９９一Ｏ．４０Ｘ（Ｒ２＝０．９９）；抗体对

ＺＥＮ５０％的抑制浓度为１６．３ｎ∥ｍｌ；对玉米和小麦的平均加标回收率分别是９６．５％和９５．５％，变异系数分别是

１３．２％和１０．９％；试剂盒４℃保质期超过６个月；对参试真茵毒素的交叉反应率均小于ｌ％；实验室内的变异

系数小于１５％，实验室间变异系数小于２０％；用本法与ＨＰＬＣ法同时检测美国维康公司玉米赤霉烯酮盲样，

结果均在允许范围之内，且两种检测方法无差别。结论该试剂盒各项指标符合相关技术要求，具有快速、

灵敏、稳定、专一的特点。

关键词：玉米赤霉烯酮ＥＬＩＳＡ试剂盒

中图分类号：Ｒ１５５．５１ＴＳ２０７．４文献标识码：Ｂ

ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＥＬＩＳＡ－ｋｉｔｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒＺｅａｒａｌｅｎｏｎｅ

ＷａｎｇＹｕ—ｐｉｎｇ，ＪｉＲｏｎｇ，ＪｉａｎｇＴａｏ，ＫａｎｇＷｅｉ—ｊｕｎ，ｅｔａｉ．

ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＦｏｏｄＳａｆｅｔｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２１，Ｃｈｉｎａ

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｖｅｌｏｐｅａｒａｐｉｄ．ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＥＬＩＳＡ—ｋｉｔｆｏｒＺｅａｒａｌｅｎｏｎｅａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｅ

ｈｅ　ｒｅｓｅａ　ｒｃｈ　ｒｅｖｉｅｗｅｄ　玉米赤霉烯酮对母猪生殖毒性研究进展　俞亚玲　，陈少谋　，尚红梅ｚ　（１．陕西省安康市畜牧兽医中心，陕西安康７２５０００；２．咸阳市动物疫病预防控制中心．陕西成阳７１２００）　摘要：玉米赤霉烯酮是一种具有雌激素样生物活性的真菌　毒素。主要影响动物生殖机能。本文通过玉米赤霉烯酮对母猪的　生殖系统毒性的研究进展加以综述．为预防和治疗该毒素引起　的母猪疾病提供理论依据。　关键字：玉米赤霉烯酮：生殖毒性　玉米赤霉烯酮（ＺＥＡ）是一种污染玉米等作物的霉菌毒素　玉米等谷类作物在生产、收获、加工、运输、贮藏等环节容易受到　污染。Ｔａｎａｋａ等（１９９０）收集了１９个国家．５００多个样品进行检　测，检出ＺＥＡ的阳性率达４４％。ＺＥＡ分布很广．使用ＥＬＩＳＡ测定　分别从华中、华北、华南的仓库、饲料厂等采集的多个样品，ＺＥＡ　的检出率高达１００％　ＺＥＡ的污染在被检的饲料和原料中最为严　重（王若军等２００３）。根据中国有关规定。ＺＥＡ的最高限量为１００　微克／千克．长期采食ＺＥＡ超标的饲料会损害母猪生产性能　ＺＥＡ在动物体内吸收速率较快．猪采食ＺＥＡ后有８０％的　ＺＥＡ会被吸收。据Ｒａｉｎｅｙ等（１９９０）研究指出，饲喂７０日龄母猪　（ＺＥＡ含量２毫克／千克）的饲料。７天母猪阴户就会出现红肿。　Ｅｄｗａｒｄｓ等（１９８７）研究，给母猪饲喂（ＺＥＡ含量１０毫克／千克）的　饲料，３　５天就会出现阴户红肿的现象。赵虎等（２００８）研究指出　仔猪采食（ＺＥＡ含量３毫克／千克）的日粮，第３天便有一头仔猪　阴户出现红肿现象．两周后仔猪的阴户全部出现红肿　这些研究　结果说明ＺＥＡ在猪体内不仅有较快的吸收速度．同时对机体生　殖器产生影响也较快　母猪在不同阶段ＺＥＡ中毒临床反应也不　同：后备母猪ＺＥＡ中毒会引起持续性假发情．屡配不孕：怀孕母　猪ＺＥＡ中毒，会影响胎儿。所产仔猪会出现外生殖器肥大：怀孕　母猪ＺＥＡ中毒流产、早产、死胎等发生率增加；哺乳母猪ＺＥＡ中　毒则发生乳腺肿大、泌乳量减少（单妹等，２００５）。　ＺＥＡ能与雌激素受体结合表现出弱雌激素活性．造成动物　体生殖激素紊乱．破坏动物生殖系统．对动物生殖机能造成损　害。所有动物中猪对ＺＥＡ最为敏感。研究证明．ＺＥＡ中毒而激发　目的器官的一系列反应与雌二醇Ｅ２一致（Ｕｒｒｙ　ｅｔ　ａ１．１９６６）　ＺＥＡ　及其代谢物与雌激素受体结合（ＥＲ）后．从细胞质转移至细胞核　需要更长的时间（与Ｅ２相比），其他过程与Ｅ２一致。ＺＥＡ的毒性　大小与其代谢产物中的０【一ＺＥＬ的含量有关．ｏｔ—ＺＥＬ的含量越大　毒性越大（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ｅｔ　ａ１．２０００）。与Ｅ２相比，ＺＥＡ中毒会引起外　阴异常肥大、阴道外翻、乳腺肿胀等雌激素中毒症状（ＭｃＮｕｔｔ　ｅｔ　ａ１．１９２８）。　ＺＥＡ可以引起母猪假发情以及延长发情间隔　有试验表　明：从青春期开始，每头母猪每日饲喂２千克ＺＥＡ含量（３．６１毫　克／千克或４．３３毫克／千克）的日粮．出现假性妊娠的母猪占的　４５％。在Ｙｏｕｎｇ等（１９８６）试验中，每天给予青春期母猪６毫克／千　克或９毫克／千克的ＺＥＡ，也会得到同样的结果．通过血中黄体　水平检测和生殖道检查发现，８８％的母猪都出现假妊娠　在发情　期５天到２０天，饲喂ＺＥＡ含量分别为（４Ｏ微克／千克、２００微克／　千克、４００微克／千克），结果发现发情间隔和黄体维持的时间都　延长了（Ｅｄｗａｒｄｓ等，１９８７）。在母猪动情周期第６至１０天或１ｌ　至１５天给予母猪２０毫克ＺＥＡ，母猪的发情间隔时期显著延长　、　（Ｆｌｏｗｅｒｓ．ｅｔ　ａｌ　１９８７）。给发情周期第５至２０天的母猪饲喂５毫　克／千克或者１０毫克／千克的纯ＺＥＡ，母猪动情间隔时期也显著　延长（Ｅｄｗａｒｄｓ．ｅｔ　ａｌ　１９８７）。引起母猪发情间隔时期延长是因为血　液中孕酮保持着一个很高的水平。黄体的功能持续存在　因此．　ＺＥＡ可能起到一个促黄体生成的作用并延长黄体的作用时间　ＺＥＡ影响猪卵母细胞体外成熟，Ａｉｍ等（２００２）等研究了不　同剂量ＺＥＡ及其代谢物在体外对猪的卵母细胞成熟的影响．发　现ｏｒ．一ＺＯＬ和Ｂ—ＺＯＬ的剂量与猪卵母细胞成熟和退化率呈现正　比。体外培养卵母细胞暴露于浓度为７．５ｒａｍｏｌ／Ｉａ—ＺＯＬ中４８小　时，会引起卯母细胞的成熟率降低　当ＺＥＡ的代谢物０【一ＺＯＬ的　浓度达到７．５～３０百万分比浓度时．卵母细胞的成熟率显著降低．　其受精率也降低。研究表明。ＺＥＡ代谢物　～ＺＯＬ是通过影响减数　分裂时纺锤体的功能．从而减少卵母细胞的成熟以及形成多倍　体胚胎（Ｍａｌｅｋｉｎｅｊａｄ　ｅｔ　ａ１．２００７）。ＺＥＡ在较高的水平ｆ３０—　１２０ｍｍｏｌ／Ｌ）能减少猪卵巢颗粒细胞的增值．并能引起颗粒细胞　凋亡和坏死．从而影响卵巢颗粒细胞孕酮的合成（Ｚｈｕ　Ｌ．ｅｔ　ａｌ　２０１２）。　玉米赤霉烯酮的类雌激素作用．直接损害了动物的生殖系　统。导致动物生殖机能紊乱，造成严重的经济损失。国内外研究　者做了大量的研究来揭示ＺＥＡ生殖毒性机理．但是ＺＥＡ在动物　体内的吸收、转化和代谢过程比较复杂。且ＺＥＡ还会与体内的某　些物质产生相互作用　因此需要对ＺＥＡ进行更深入的研究．以便　预防和控制ＺＥＡ对动物以及人类健康可能产生的危害　参考文献　［１】ＴａｎａｋａＴ，Ｓ　Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ　Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｎ　ｈｏｋｉ，ＪＲ　Ｂｅｓ１ｉｎｇ，Ｙ　Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｙ　Ｕｅｎｏ．１９９０．Ａ　ｓｕｒｖｅｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎａｔｕｒａ１　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｆｕｓ　ｒｉｕｎ　ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ，ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏ１，ｎｉ—　ｖａｌｅｎｏ１　ａｎｄ　ｚｅａｒａ１ｅｎｏｎｅ．ｉｎ　ｃｅｒｅａ１　ｓ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒ１ａｎｄｓ．Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ　１１　０：１　９－２２．　［２］王若军．２００３．中国饲料及饲料原料受霉菌毒素污染的　调查报告．饲料工业，２４（７）：５　３—５４．　［３］Ｒａｉｎｅｙ，Ｍ．Ｒ．，Ｔｕｂｂｓ，Ｒ．Ｃ．，Ｂｅｎｎｅｔ，Ｌ．Ｗ．＆Ｃｏｘ，

动物营养学报２０１８ꎬ３０(８):３２８５￣３２９２ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ　

ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００６￣２６７ｘ.２０１８.０８.０４８

玉米赤霉烯酮对体外培养鸡脾脏

淋巴细胞凋亡的影响

李欣虹１　郑若愚１　辜彦霏１　陶思邑１　任志华１　王亚超２　邓俊良１∗

(１.四川农业大学动物医学院ꎬ成都６１１１３０ꎻ２.西南科技大学ꎬ绵阳６２１０１０)

摘　要:本试验旨在研究玉米赤霉烯酮(ＺＥＡ)对体外培养鸡脾脏淋巴细胞凋亡的影响ꎮ选用４０~６０日龄健康的伊莎公鸡ꎬ无菌条件下取脾脏ꎬ制备淋巴细胞悬液ꎮＺＥＡ染毒浓度为０(对

照)、０.１０、０.４０、１.６０、６.２５和２５.００μｇ/ｍＬꎬ染毒４８ｈ后检测体外培养鸡脾脏淋巴细胞凋亡率、

坏死率、细胞线粒体膜电位、细胞内活性氧(ＲＯＳ)含量以及Ｂ淋巴细胞瘤－２(Ｂｃｌ￣２)、Ｂｃｌ￣２相关Ｘ蛋白(Ｂａｘ)、Ｂａｋ￣１、ｐ５３及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－３(ｃａｓｐａｓｅ￣３)ｍＲＮＡ表达量及细胞培养

液上清中上述相应凋亡基因蛋白含量ꎮ结果显示:与对照组比较ꎬＺＥＡ染毒导致鸡脾脏淋巴凋

亡率、坏死率、ＲＯＳ含量、细胞培养上清液中ｐ５３、Ｂａｘ、Ｂａｋ￣１及ｃａｓｐａｓｅ￣３的含量以及细胞内ｐ５３、Ｂａｘ、Ｂａｋ￣１及ｃａｓｐａｓｅ￣３的ｍＲＮＡ表达量显著或极显著提高(Ｐ<０.０５或Ｐ<０.０１)ꎬ且随毒素

浓度升高而升高ꎻ而ＺＥＡ组细胞线粒体膜电位和上清液Ｂｃｌ￣２含量却极显著低于对照组(Ｐ<０.０１)ꎮ由此可知ꎬＺＥＡ染毒可促进体外培养鸡脾脏淋巴细胞凋亡ꎬ且呈剂量依赖性ꎮ

关键词:玉米赤霉烯酮ꎻ鸡脾脏淋巴细胞ꎻ凋亡ꎻ线粒体ꎻ活性氧

中图分类号:Ｓ８１６ 文献标识码:Ａ 文章编号:１００６￣２６７Ｘ(２０１８)０８￣３２８５￣０８

收稿日期:２０１８－０１－０５基金项目:国家自然科学基金项目(３１４０２２６９)ꎻ四川农业大学２０１８年本科生科研兴趣培养计划项目作者简介:李欣虹(１９９７—)ꎬ女ꎬ四川凉山人ꎬ本科生ꎬ从事动物中毒病理研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:１８７１４２６１７４＠ｑｑ.ｃｏｍ∗通信作者:邓俊良ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｄｅｎｇｊｌ２１３＠１２６.ｃｏｍ 玉米赤霉烯酮(ＺＥＡ)又称Ｆ￣２毒素ꎬ是由镰