南方根结线虫侵染烟草抗感品种前后的代谢组学分析田培，李晓辉，贺文俊，段杜薇，徐世晓，杨铁钊河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95号 450002摘 要：为明确南方根结线虫侵染烟草抗感品种前后代谢途径的差异，选取烟草抗病品种G28与感病品种长脖黄壮苗为试验材料，设置4个处理：1）G28接种J2s 悬浮液（G_RKN ）；2）长脖黄接种J2s 悬浮液（C_RKN ）；3）G28接种清水（G_CK ）；4）长脖黄接种清水（C_CK ）。
每个处理3次重复。
采用LC/MS 技术分析接种前后代谢通路的变化。
结果表明，南方根结线虫侵染的抗、感病品种G28与长脖黄在抗病相关的代谢通路都有明显变化，鉴定出的差异代谢物包括了生物碱、脂肪酸、类黄酮、萜类和聚酮等物质。
其中抗病品种被显著激活的代谢通路有10条，而感病品种只有5条。
所以抗、感品种被南方根结线虫侵染后防御能力不同。
关键词：南方根结线虫；烟草；代谢组学；LC/MS ；代谢通路基金项目：河南省自然科学基金（162300410144）作者简介：田 培（1994—），硕士研究生，主要从事烟草育种研究，Email ：tiantianannsnow@通讯作者：杨铁钊（1955—），教授，博士生导师，主要从事烟草遗传与育种以及新品种选育研究， Email ：yangtiezhao@ 烟草根结线虫病是世界各国烟草生产中的主要病害之一，尤其以南方根结线虫危害为重。
我国烟区南方根结线虫病发生范围广、危害重、防治难度大[1-3]。
受环境和经济水平所限，我国大部分缺水旱作烟区无法开展水旱轮作，多采用化学手段防治，虽取得了一些成效，但也造成了烟叶农药残留增加、烟叶品质下降和环境污染加重等后果[4]。
不同烟草品种对南方根结线虫表现明显的抗性差异，种植抗病品种或抗/耐基因的利用是防治根结线虫病最有效、最经济和最环保的方法[5]。
在烟草与根结线虫的互作中，烟草细胞识别线虫入侵后，会激活自身免疫反应，包括抗病相关的代谢产物的合成，或者信号分子的产生以调节代谢过程[6]。
代谢组学主要是比较两组或多组生物样本之间代谢模式的差异，进一步研究一些关键的不同代谢物的功能和意义[7]，在药物作用机理研究、功能基因研究、代谢途径及网络调控机理解析、作物育种等许多领域有广泛应用[8]。
根结线虫侵染烟草过程中互作方面的研究多在转录组和蛋白组的水平[9-10]，而涉及烟草代谢组学的研究多集中在基因功能解析、不同组织器官代谢差异、烟草香味物质调控等方面[11-12]。
利用代谢组学手段研究根结线虫侵染抗感烟草品种代谢途径的差异还未见相关报道。
本研究以抗病品种G28与感病品种长脖黄为材料[13-14]，采用LC/MS 分析技术，探讨其受南方根结线虫侵染后在代谢组水平上发生的变化。
通过对差异代谢物和代谢途径的分析，为烟草与南方根结线虫互作机理的深入研究和根结线虫病的防治提供参考。
1 材料与方法1.1 试验材料试验于2017年在河南农业大学科教园区进行。
供试烟草品种为抗病品种G28与感病品种长脖黄，均由河南农业大学育种实验室提供。
南方根结线虫由云南农业大学提供病土培养番茄，按照刘维志[15]的研究方法分离获得。
所用试剂包括：甲醇、甲酸、水、乙腈、碳酸氢铵均购自CNW 公司，L-2-氯苯丙氨酸购自上海恒创生物科技有限公司。
所有化学药品和溶剂均为分析纯或色谱级。
1.2 试验方法1.2.1 试验设计G28（G ）与长脖黄（C ）均播于无菌基质的穴盘中，并进行标准化育苗。
成苗后，选取长势均匀的壮田培，李晓辉，贺文俊，等. 南方根结线虫侵染烟草抗感品种前后的代谢组学分析[J]. 中国烟草学报，2019，25（3）. TIAN Pei, LI Xiaohui, HE Wenjun, et al. Metabonomics analysis of resistant suceptible tobacco varieties before and after infection by Meloidogyne incognita [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2019, 25(3). doi: 10.16472/j.chinatobacco.2018.261苗移入塑料盆（直径10 cm，高8.3 cm）中，每个塑料盆栽一棵，按照随机区组排列。
移栽10 d后，每个品种选择长势均匀一致，无病害的壮苗，设置4个处理：1）G28接种J2s悬浮液（G_RKN）；2）长脖黄接种J2s悬浮液（C_RKN）；3）G28接种清水（G_ CK）；4）长脖黄接种清水（C_CK）。
每个处理（含3株烟苗）重复3次。
接种10 d后，将4组处理分别拔出根部，用清水冲洗干净，放入液氮中保存备用。
1.2.2 南方根结线虫的繁育与接种南方根结线虫在感病番茄品种早丰中扩繁。
番茄移栽后3个月，出现明显根结时，选取有南方根结线虫卵块的根结，用1%的NaClO液消毒，再用去离子水冲洗干净，放置于26℃恒温培养箱中孵化。
3~4 d 后收集孵化出的二龄幼虫（J2s），显微镜下计数，制成300条/mL的J2s悬浮液，在24h内进行接种处理。
接种方法为在烟株根部周围（1~2 cm左右）打孔（5孔/盆），在孔内注入5 mL悬浮液/清水，用基质掩埋[16]。
1.2.3 LC/MS样品前处理[17]烟草根部磨碎后称取80 mg，放入1.5 mL离心管中，加入20 μL内标（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置）和1 mL的甲醇与水混合液（体积比为7:3）； -20℃放置2 min预冷，加入研磨机研磨2 min （60 Hz,）；继而超声提取30 min（4℃）； -20℃静置20 min后，离心15 min（13000 rpm，4℃），用注射器吸取200 μL上清液，每个样品重复3次，并将3次上清液合并；使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到LC进样小瓶，-80℃条件下保存，进行LC- MS分析。
1.2.4 LC/MS分析采用沃特世科技有限公司的UPLC超高效液相色表1洗脱梯度Tab.1 Elution gradient时间/min A/%B/%095528020475259406017010019010019.195520.1955谱与ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，柱温45℃，流动相A为含0.1%甲酸的超纯水，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；流速为0.4 mL/min，进样体积为5 μL。
洗脱梯度见表1。
采用美国应用生物系统公司的高分辨质谱仪。
质谱条件为电喷雾离子源ESI，样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式。
质谱参数见表2。
表2质谱参数Tab.2 Mass spectrometry parameter参 数正离子负离子Nebulizer Gas (GS1, PSI)4040 Auxiliary Gas (GS2, PSI)4040 Curtain Gas (CUR, PSI)3535 Ion Source Temperature (℃)550550 Ion Spray V oltage (V)55004500 Declustering Potential (DP, V)100-100 Mass Scan Range (TOF MS scan)70-100070-1000 Collision Energy (TOF MS scan, eV)10-10 Mass Scan Range (Product Ion scan)25-120025-1200 Collision Energy (Product Ion scan, eV)3030 Interface Heater Temperature (℃)550600质控样本（QC）由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个质控样本的体积以及分析方法与样本完全相同，在分析过程中，每10个分析样本中插入一个质控样本。
1.2.5 数据分析流程首先通过去噪平滑，基线矫正，重叠峰识别等步骤提取LC/MS数据。
其次对4组烟草样本（G_ RKN、G_CK、C_RKN、C_CK）的代谢组原始数据采用有监督的偏最小二乘法（PLS-DA）与正交偏最小二乘法（OPLS-DA）进行分析。
再应用中国科学院大连化学物理研究所与大连达硕信息技术有限公司联合开发的代谢组学小分子化合物快速鉴定分析软件系统（OSI / SMMS）鉴定差异代谢物。
所用数据库为The Human Metabolome Database（HMDB，网址：http：//www.hmdb.ca/）和METLIN的一级数据（网址：https：///），并参考中国科学院大连化学物理研究所与大连达硕信息技术有限公司建立的标准物质数据库（Main Standard Library）。
OPLS 建[18]异代谢物的标准为OPLS-DA 模型第一主成分的VIP 值>2，t 检验（student’s t test ）的P <0.05。
最后把差异代谢物映射到KEGG 数据库（网址：http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html ），使用MBRole （http ：//b.csic.es/mbrole/）网站的ID 转换功能，获取差异代谢物的KEGG 的物质 ID 号，再通过MBRole 通路分析功能，利用差异代谢物的KEGG ID 进行通路富集分析，获得代谢通路富集结果。
2 结果与分析2.1 G28与长脖黄根部样品的 LC/MS 分析和数据预处理图 1 为正离子模式下抗病品种G28根部典型的基峰离子流图，图2为正离子模式下感病品种长脖黄根部典型的基峰离子流图。
原始质谱数据经过XCMS 软件处理后检测到2978个代谢物（由保留时间和质荷比值组成的数据对表示）。
图1 G28处理组与对照组样品的基峰离子流图Fig. 1 Base peak ion current chromatograms of G28 roots of the treatment group and control groupG_RKNG_CK图2长脖黄处理组与对照组样品的基峰离子流图Fig. 2 Base peak ion current chromatograms of Changbohuang roots of the treatment group and control group2.2 根结线虫诱导差异代谢产物的鉴定图3是4组烟草样本的PLS-DA 分析的得分图，处理组和对照组的分离趋势明显。
由模型参数表3得，两个主成分的累计值 Q 2（cum ）分别高达 0.995与0.998，且两个成分对 X 和 Y 的累积解释能力 R 2X （cum ）和 R 2Y （cum ）分别为 0.819、1与0.925、1，说明模型的稳定性和可预测能力以及对数据的拟合度为防止模型过拟合，同时获得导致两组样本存在差异的准确代谢物信息，采用七次循环交互验证（7-fold cross validation ）和200次响应排序检验（response permutation testing ，RPT ）的方法来考察模型的质量。
![一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/fd47c41dfab069dc51220115.png)
