5 植物细胞工程制药

二、植物细胞的结构特征
细胞壁 细胞质 内质网 高尔基体 线粒体 叶绿体 等。 细胞核 液泡
三、植物细胞主要生理活性物质及其他化学组分
1.生理活性物质 一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节 作用的物质的总称，包括酶、维生素、植物激素 、抗生素和植物杀菌素等。 2.后含物 植物细胞储藏的物质或者废弃物质，包括生 物碱、苷类、有机酸、挥发油等。
3.培养基的制备 （1）母液的配制和保存： 培养基母液是指按培养基配方配制浓度高10~100倍 的高浓度溶液。 （2）配制培养基： 100ml大量元素 + 10ml微量元素 + 10ml铁盐+ 10ml 有机物 + 生长物质 + 30g蔗糖 + 7g琼脂，定容1L，煮沸 溶解后灭菌备用。 灭菌后的培养基一般隔天再用，因pH变动（偏酸 0.1~0.3 pH ）。 培养基在低温暗中可保存一段时间（<1个月）。
5.基因工程 基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后 必须通过组织培养途径才能实现植株再生。
Regeneration of Plants from Cells or Tissue Is an Important Research Tool
This is the most common way of producing transgenic Arabidopsis.
快速繁殖实现工厂化育苗(特点：繁殖快，性状稳定，整 齐一致，无病虫害，周期短，周年生产。)
（三）植物细胞工程育种 1.利用培养变异，筛选优良突变体 植物离体培养，能够明显提高突变率，并且 会有各种各样的生理和形态突变，如株高、花色、 植株形态、生育期、耐性等。可以从中选择优良 突变体，培育新品种。
2 .利用远缘杂交幼胚培养，获得杂种植株， 克服其杂交不亲和性 有些植物远缘杂交，能正常受精，但受精胚往 往败育。这种情况下，可以将幼胚在败育前进行 离体培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功， 获得缘远杂种植株，从而育成一些罕见的新物种 。
3.利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性 野生种往往有许多优良性状，但大部分与栽培种 杂交不亲和，严重影响了野生种优良遗传基因的应 用。利用细胞融合，可以克服这种杂交不亲和性， 获得体细胞杂种，使野生种的利用成为可能。 4.倍性育种，缩短育种年限
（3）植物生长物质： A 生长素：主要用于诱导细胞的分裂（愈伤组织的形成） 和根的分化，如IAA，NAA，IBA，2,4－D。 B 细胞分裂素：主要用于促进细胞分裂和由愈伤或器官上 分化不定芽，也用于茎芽增殖，常用6-BA、KT、ZT。 （4）琼脂与pH值： 琼脂是由海藻得来的多糖类物质，一般用0.7～1.0％。 pH一般为5～7间，常用 5.8。pH> 6.0，培养基变硬； pH< 5.0，琼脂不凝固。 （5）维生素： 植物细胞通常是维生素自养型，但合成量太少，需要 额外加入少量的维生素。
1962年Marshing和Skoog在烟草培养中筛选 出至今仍被广泛使用的MS培养基。 1964年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼 陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体 植株。
3、应用研究阶段（20世纪70年代以后）
1971年，Takebe 等从烟草原生质体得到再生 植株，首次获得原生质体植株再生成功。 1972年，Carlson 等通过两个烟草物种之间原 生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。
6.植物无菌培养 愈伤组织:愈伤组织是指从植物受伤部位或组织培养物 产生的由分化和未分化细胞组成的一类薄壁组织。 7.细胞培养 8.分生组织培养 9.外植体：在植物组织培养过程中，接种在培养基上的 无菌细胞、组织、器官等均称为外植体。 10.无性繁殖系 11.突变体 12.继代培养 13.次级代谢作用和次级代谢产物 生物碱、黄酮体、萜类等有明显的生理活性。
植 所采用技术 物 的理论基础 细 胞 工 程 通常采用的
植物细胞的全能性
植物组织培养 植物体细胞杂交
技 术 手 段
二、植物细胞工程的主要应用
（一）种苗脱毒 茎尖培养可以得到无病毒苗木已成为解决病
毒病危害和品种退化问题的一个重要途径。
（二）快速繁殖
许多植物名贵是因为繁殖系数太低，种子结 实率低或者不结种子，而营养繁殖又很慢。利用 组织培养再生植株，进行大量繁殖，可以大大提 高繁殖系数。目前组织培养快速繁殖已在许多植 物上应用， 最早是兰花（60年代）。
三、培养方法 按培养对象分：原生质体培养和单倍体细胞培养； 按培养基类型分：固体培养和液体培养； 按培养方式分：悬浮细胞培养和固定化细胞培养。
植物组织固体培养举例
切取
接种
愈伤组织的形成
移栽
试管苗的形成
分化形成小芽或根
1、过程
脱分化 离体植 愈伤组织
再分化 胚状体 根芽 植物体
物细胞
（外植体）
优势？
1960年，Cocking 等用 真菌纤维素酶分离植物原生 质体获得成功。这是植物组 织培养的第二次突破 。
Edward C. Cocking
1960年G.Morel采用兰花的茎 尖培养，实现了去病毒和快速繁 殖两个目的。这是经过茎尖—原 球茎—小植株的方式而再生的。 G.Morel Morel提出的这种离体无性繁殖方法，其繁殖 系数极高，很快被兰花生产者所采用，迅速建立 起兰花工业。植物离体微繁技术及脱毒技术得到 了迅速发展，实现了产业化。
2.培养基的组分 （1）无机营养成分： 植物生长发育必需的元素为14种： 大量元素 N、P、 K、Ca、S、Mg（大于30mg/L） 微量元素 Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Cl、Ni（小于 30mg/L） （2）有机营养成分： A 碳源：为生长发育提供碳骨架和能源，维持培养基的渗 透平衡。主要为糖类，常用蔗糖。一般用量为2～5%。 B 有机N源：构成蛋白质和核酸等生物大分子的组成分， 并提供激素。如蛋白质水解产物、氨基酸和有机复合物 。
（1）基本培养基：包括大量元素和微量元素、维生素和 氨基酸，还有碳源和水。常见的有MS、White、 Nitsch、B5和N6等。 完全培养基：根据各种不同试验要求，在基本培养 基中附加一些物质，如各种植物生长物质以及其它有机 附加物（如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麦芽 等）。 （2）根据培养基的物理状态分： 液体培养基和固体培养基 （3）根据培养基的无机盐分： 高盐(MS)、中盐(Miller)、低盐(White)培养基 （4）根据培养物分： 愈伤组织培养基、芽增殖培养基、生根培养基、细胞培养 基和原生质体培养基等
（1）原生质体培养取得重大突破 （2）花药培养取得显著成绩
（3）微繁技术广泛应用
第三节 植物细胞的形态及生理特性
一、植物细胞的形态
多细胞植物其细胞形态多种多样，球形、 类圆形、椭圆形、角形；具；具有输导作 用的细胞管形。
细胞大小不一，基本组织细胞体积较大直径在 20～100微米之间，储藏组织细胞的直径可达1毫 米，最长的细胞是无节乳管长达数米至数十米。
1948 年，Skoog和崔徵通
过对烟草茎切段和髓培养组
织的研究，确定了腺嘌呤／
生长素的比例是控制芽和根
F.Skoog
形成的主要条件之一。
1956年Miller等发现了激动素。控制器官分 化的激素模式变为激动素／生长素的比例关系。
促进组培发展。
1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组 织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整 的小植株，首次获得植株再生成功。使细胞全能性理论 得到证实，这是植物组培的第一次突破。
第一节 基本概念
1.植物细胞的全能性：植物体中任何一个具有完整 细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下 都可以重新再分化形成原来的个体。
2.植物组织和器官培养：在无菌和人工控 制条件下（培养基、光照、温度等），研 究植物的细胞、组织和器官以及控制其生 长发育的技术。 3.植物的分化：高等植物的分化分为胚胎 发生和器官发生两个阶段。 4.脱分化:已经分化的细胞、组织和器官在 人工培养的条件下又变成未分化的细胞和 组织的过程。 5.再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组 织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状 体或直接分化成器官。
作为一门技术，必须具有一定的程序性（技术模式）。 在这一阶段植物组织培养建立了2个与培养技术有关的重 要模式：培养基模式、激素调控模式。
1934年美国的White，利用番茄根 建立了第一个活跃生长的无性繁殖系， 发现B族维生素对培养的离体根生长具 有重要作用。
创立了White培养基。 1943年White发表了《植物组织培养 手册》的专著，使植物组织培养开始成 为一门新兴的学科。 P.R.White
•二 植物培养细胞的生理特性
（1）细胞个体较大（较微生物细胞大得多），有 纤维细胞壁，细胞抗剪切力差。 （2）细胞生长速度较慢，容易被微生物污染，培 养时需添加抗生素 （3）细胞培养过程中易聚集成团，较难进行悬浮 培养。 （4）培养时需供养，但培养液粘度较大，不能耐 受强力通风搅拌。 （5）细胞培养产物滞留于细胞内，产量低。 （6）植物细胞具有结构和功能全能性，即培养的 细胞可以分化成完整的植株。
3.诱导培养 （1）外植体的切割： 叶片0.5～0.8 cm2；茎段和顶芽以１cm长为宜。 （2）接种： 形态学下端插入培养基（如茎切段），叶平铺。 不可将切块深埋于培养基中，以防无氧呼吸。 （3）最佳培养基的筛选： 主要因素: 基本培养基，植物生长物质的种类、浓 度和配比。
二、培养基及其组成 1.培养基的种类
（四）离体种质保存 随着地球不断开发、生态环境破坏，种植资 源日趋枯竭，大量有用基因损失。利用组织培养 法，低温保存（－196℃）或试管保存，为保存和 抢救濒临灭绝的生物带来希望。 （五）细胞培养生产有用物质（生物 制品） 利用细胞培养生产次生物质，如药物、色素、 食品添加剂、酶、农药等。有些极其昂贵的生物 制品，如抗癌首选药物--紫杉醇等，可以用大规模 培养植物细胞来直接生产。