1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法

《胚胎工程实验技术》讲义一、胚胎工程的概述胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。

其目的是通过这些技术，对动物的生殖过程进行干预和调控，以获得人类所需的优良品种、生物制品或医疗手段。

胚胎工程是现代生物技术的重要组成部分，它在畜牧业、医学、生物学等领域都有着广泛的应用和重要的意义。

例如，在畜牧业中，通过胚胎移植技术，可以快速扩大优良种畜的种群；在医学领域，胚胎干细胞的研究为治疗多种疾病带来了希望。

二、胚胎工程的实验技术（一）体外受精技术体外受精是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。

其主要步骤包括：1、卵母细胞的采集：可以通过从卵巢中直接采集、从已屠宰动物的卵巢中采集或借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜等工具直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。

2、精子的采集和获能：采集的方法包括假阴道法、手握法和电刺激法等。

采集后的精子需要在体外经过获能处理，才能使精子具有受精能力。

3、受精：将成熟的卵子和获能的精子在适宜的培养液中共同培养一段时间，完成受精过程。

（二）胚胎移植技术胚胎移植是指将雌性动物体内的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。

胚胎移植是胚胎工程中的最后一道“工序”，其基本程序包括：1、对供、受体的选择和处理：选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体。

对供、受体进行同期发情处理，使它们的生理条件达到同步或一致，以提高胚胎移植的成功率。

2、配种或进行人工授精：使供体发情排卵，进行自然交配或人工授精。

3、胚胎的收集、检查、培养或保存：配种或输精后第 7 天，用特制的冲卵装置，把供体子宫内的胚胎冲洗出来。

对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹胚或囊胚阶段。

直接向受体移植或放入液氮中保存。

胚胎工程探究点一体外受精和早期胚胎培养1、采集卵母细胞一是给母畜注射一定量的促性腺激素，促使卵巢产生更多的卵母细胞，然后利用超声波引导法从母畜卵巢内采集这些卵母细胞；二是从屠宰的母畜卵巢内直接获取卵母细胞。

2、体外成熟刚获取的卵母细胞还没有发育成熟，不能与精子受精。

在人工模拟环境(如温度、营养、pH等)条件下，使获取的卵母细胞发育成熟。

3、采集精子和获能常用方法有假阴道法、手握法和电刺激法。

获能方法有培养法和化学诱导法。

4、体外受精将人工采集的公畜精液与已经成熟的卵母细胞混合，使精子和成熟的卵母细胞在母畜体外完成受精，该过程称为体外受精。

5、试管动物生产流程【说明】用于体外培养的卵细胞的选择在选择卵母细胞时，无论用哪种方法采集到的卵母细胞，外围一般都应该有数层卵丘细胞所包围，形成一个叫卵丘复合体的结构(COC)，这种结构对于卵母细胞在体外条件下的成熟是十分重要的。

在对家畜体外受精的操作中，一般把未成熟的卵母细胞分成A、B、C、D 四级。

对A级卵母细胞的要求是有3层以上卵丘细胞包围，卵母细胞的细胞质均匀；B级是少于3层卵丘细胞，但卵母细胞质要均匀；C级为没有卵丘细胞包围的卵母细胞，又称为裸卵，培养效果很差；D级是退化或死亡的卵母细胞，应淘汰。

A、B两类卵母细胞培养效果较好。

6、胚胎的早期培养(1)培养液成分。

两“盐”：无机盐和有机盐；两“素”：维生素和激素；两“酸”：氨基酸和核苷酸；另有水、血清等物质。

(2)不同动物胚胎移植的时间不同。

①牛、羊一般要培养到桑堪胚阶段或囊胚阶段才能进行移植。

②小鼠和家兔等实验动物可在更早的时间移植。

③人的体外受精胚胎，可在4个细胞阶段移植探究点二胚胎移植、胚胎分割和胚胎干细胞1、胚胎移植的培育流程以牛胚胎移植为例：【说明】(1)“供体”与“受体”的确定：提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”；供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。

一、实验目的1. 掌握小鼠胚胎的采集方法。

2. 了解小鼠胚胎的发育过程。

3. 培养实验操作技能。

二、实验原理小鼠胚胎的获得是通过人工操作，将雌鼠的受精卵取出，进行体外培养，直至发育成胚胎。

该实验旨在研究小鼠胚胎的发育过程，为后续的胚胎移植、基因编辑等研究提供基础。

三、实验材料1. 实验动物：雌性小鼠、雄性小鼠2. 实验仪器：显微镜、解剖显微镜、培养箱、离心机、培养皿、手术器械等3. 实验试剂：生理盐水、DEPC水、培养液、抗凝剂、消毒剂等四、实验步骤1. 实验动物处理（1）将雌性小鼠和雄性小鼠分别饲养于清洁、通风的动物房中，保持适宜的饲养条件。

（2）雌性小鼠和雄性小鼠分别进行交配，交配后观察雌性小鼠的阴道涂片，确认受精情况。

2. 胚胎采集（1）雌性小鼠交配后第2天，用解剖显微镜观察雌性小鼠的阴道涂片，确认受精情况。

（2）雌性小鼠交配后第3天，将雌性小鼠麻醉，固定于解剖显微镜下。

（3）用手术器械取出雌性小鼠的子宫，置于培养皿中。

（4）在解剖显微镜下，用镊子取出受精卵，置于培养皿中。

3. 胚胎培养（1）将受精卵放入培养箱中，在37℃、5%CO2、95%空气的条件下培养。

（2）观察受精卵的发育过程，记录胚胎的形态变化。

4. 实验结果分析（1）观察胚胎的发育过程，记录胚胎的形态变化。

（2）分析胚胎发育过程中各阶段的形态特征。

五、实验结果1. 胚胎发育过程（1）受精卵在培养箱中培养24小时后，可见胚胎开始分裂。

（2）培养24小时后，胚胎发育至桑椹胚阶段。

（3）培养48小时后，胚胎发育至囊胚阶段。

（4）培养72小时后，胚胎发育至原肠胚阶段。

2. 胚胎形态特征（1）受精卵：透明、圆形，直径约100μm。

（2）桑椹胚：细胞数目增多，排列紧密，形成桑椹状。

（3）囊胚：细胞分化明显，形成囊胚腔。

（4）原肠胚：细胞分化更加明显，形成原肠。

六、实验结论1. 通过人工操作，成功获得小鼠胚胎。

2. 小鼠胚胎在体外培养过程中，经历了受精卵、桑椹胚、囊胚、原肠胚等阶段。

《小鼠卵母细胞干细胞体外分离、建系及其功能研究》篇一一、引言随着生命科学研究的深入发展，小鼠卵母细胞干细胞的研究成为科研领域的热点之一。

通过对其体外分离、建系及其功能的研究，不仅能够加深对生殖机制的理解，还可能为生殖医学、生物医学等研究领域提供新的研究思路和治疗方法。

本文将详细介绍小鼠卵母细胞干细胞的体外分离、建系及其功能研究。

二、材料与方法1. 实验材料实验所需材料包括小鼠卵母细胞、培养基、试剂等。

选用适当的小鼠品系，如CD-1小鼠等，以确保实验的准确性。

2. 实验方法（1）体外分离采用酶消化法进行小鼠卵母细胞的体外分离。

具体步骤包括麻醉小鼠、卵巢取材、消化、洗涤等步骤。

（2）建系将分离得到的卵母细胞进行培养，通过筛选和克隆等技术建立稳定的细胞系。

（3）功能研究通过基因表达、细胞分化、细胞周期等实验手段，研究卵母细胞干细胞的生物学特性和功能。

三、实验结果与分析1. 体外分离结果经过酶消化法，成功从小鼠卵巢中分离出卵母细胞。

通过显微镜观察，可见细胞形态完整，活力良好。

2. 建系结果将分离得到的卵母细胞进行培养，经过筛选和克隆等技术，成功建立稳定的细胞系。

通过PCR、RT-PCR等分子生物学手段，验证了细胞系的纯度和稳定性。

3. 功能研究结果通过基因表达实验，发现卵母细胞干细胞具有较高的增殖能力和多能性。

通过细胞分化实验，观察到卵母细胞干细胞能够分化为不同类型的细胞，如卵泡细胞、颗粒细胞等。

此外，通过细胞周期实验，发现卵母细胞干细胞的增殖速度较快，具有较高的生物学活性。

四、讨论与展望通过对小鼠卵母细胞干细胞的体外分离、建系及其功能研究，我们得出以下结论：1. 卵母细胞干细胞具有较高的增殖能力和多能性，可分化为不同类型的细胞，具有潜在的应用价值。

2. 通过对卵母细胞干细胞的深入研究，有望为生殖医学、生物医学等研究领域提供新的研究思路和治疗方法。

3. 然而，目前关于卵母细胞干细胞的研究仍存在许多未知领域，如其在体内的生物学特性、调控机制等。

《动物胚胎工程实验教程》王子玉自编南京农业大学动科院2005年8月实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验一、实验目的 熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。

二、实验器材和材料1. 器材及药品体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。

操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。

2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。

三、实验内容1.小鼠的超数排卵注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。

注射方法皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。

随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。

皮下注射时防止药液从针孔处逸出。

腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。

注射针头宜选用小号细针头。

注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。

2.卵巢的采集方法在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。

用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。

将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。

然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。

图1－1 小鼠的固定将处死并固定好的小鼠，在下腹部中间剪开1个小口，一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部（图1-2）。

剪开腹膜，向前方揭去肠胃内脏，即暴露出生殖器官，可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角（图1-3）。

专题3 胚胎工程3.2 体外受精和早期胚胎培养『课标解读』1、知识方面简述哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。

简述哺乳动物胚胎的早期培养方法。

2、情感态度与价值观方面认同体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。

3、能力方面能够使用通俗语言介绍体外受精何早期胚胎培养技术。

『网络构建』答案：体外受精采集促性腺激素输卵管超声波探测仪腹腔镜活体卵巢假阴道法获能化学诱导血清『重难点归纳』一、卵母细胞采集的方法和操作的要领是什么？方法一：对实验动物小鼠、兔和小家畜猪、羊等卵母细胞采集时，可先用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后在适当的时间从输卵管冲取卵子，并使其直接与获能的精子在体外受精。

方法二：从刚屠宰的雌性动物体内摘取卵巢，再从卵巢中采集卵母细胞。

方法三：直接从活体动物的卵巢中采集卵母细胞，叫活体采卵。

需借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜，直接从活的动物卵巢中吸取卵母细胞。

后两种方法适用于大家畜和大动物。

注意：采集的卵母细胞需在体外培养成熟后才能与获能的精子受精。

二、如何选择用于体外培养的卵母细胞？在选择卵母细胞时，无论用哪种方法采集到的卵母细胞，外围一般都应该有数层卵丘细胞所包围，形成一个叫卵丘复合体的结构（COC）。

这种结构对于卵母细胞在体外条件下的成熟是十分重要的。

在对家畜体外受精的操作中，一般把未成熟的卵母细胞分成A、B、C、D四级。

对A级卵母细胞要求是有3层以上的卵丘细胞包围，卵母细胞的细胞质均匀；B级是少于3层卵丘细胞，但卵母细胞质要均匀；C级为没有卵丘细胞包围的卵母细胞，又称裸卵，培养效果很差；D级是退化或死亡的卵母细胞，应淘汰。

A、B两类卵母细胞培养效果较好。

三、采集精子的方法有几种？各有什么具体要求？主要分为假阴道法、手握法和电刺激法。

假阴道法是用特制的假阴道，满足雄性动物交配时对压力、温度和润滑度的要求。

同时要配备有与供精动物相适应的台畜，训练动物爬跨台畜，借假阴道收集精液。

手握法是通过徒手或戴乳胶手套的手，直接把握雄性动物阴茎，施以适当压力和刺激即可引起射精，并可收集富含精子部分的精液。

小鼠发育生物学实验内容实验一：小鼠卵母细胞和精子的形态观察一、实验目的：掌握胚胎体外操作工具的制备、小鼠超数排卵方法以及小鼠精子和不同发育阶段观卵母细胞的收集方法，观察精子结构和运动状态，评估精子活力，观察卵母细胞结构，了解体外授精操作过程。

二、操作过程：1 胚胎体外操作工具制备在酒精喷灯上将玻璃管拉成直径1mm的细管，连上乳胶管即可。

2 小鼠的抓去与保定3 收集精子断颈处死公鼠，打开腹腔，找到睾丸和附睾，剪取附睾尾，剪碎，置1.5ml离心管底部，加0.5ml 生理盐水，置37度水浴锅20分钟，用吸管从离心管上部取50微升液体，置细胞计数板，观察精子结构、密度和活力。

精子活力计算公式：精子活力＝视野中直线运动的精子数/视野中总精子数4 收集卵母细胞成熟卵母细胞的收集：母鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG（每只10单位），48小时后再注射人类绒毛膜促性腺HCG（每只10单位），18小时后断颈处死母鼠，打开腹腔，剪下输卵管，用镊子刺破输卵管壶腹部，释放卵母细胞，用透明质酸酶溶液（10毫克/毫升生理盐水）处理卵母细胞以除去颗粒细胞，在实体显微镜下观察卵母细胞的结构。

未成熟卵母细胞的收集：断颈处死性成熟前母鼠，打开腹腔，剪取卵巢，加入1毫升盐水，用刀片或镊子捣碎卵巢，寻找生发泡状态的卵母细胞，观察卵母细胞结构。

5 体外授精将卵母细胞与精子共培养（微滴培养法）（演示）三、实验结果各种精子和卵子的形态绘图；精子活力；精子密度四、实验收获与体会，存在问题和改进意见。

实验二：小鼠早期不同发育阶段胚胎的收集、观察以及胚胎移植一、实验目的：掌握小鼠附植前胚胎收集方法，观察不同发育阶段小鼠胚胎的结构，认识小鼠早期胚胎形态学，并了解体内发育阶段与所处生殖器官位置的关系，了解小鼠胚胎移植的基本原理和操作过程。

二、操作过程：1 小鼠超数排卵程序中午12时腹腔注射PMSG，48小时后腹腔注射HCG并与公鼠合笼交配，次日清晨检查阴道栓，如果发现阴道栓则妊娠0.5天。

小鼠发育生物学实验内容实验一：小鼠卵母细胞和精子的形态观察一、实验目的：掌握胚胎体外操作工具的制备、小鼠超数排卵方法以及小鼠精子和不同发育阶段观卵母细胞的收集方法，观察精子结构和运动状态，评估精子活力，观察卵母细胞结构，了解体外授精操作过程。

二、操作过程：1 胚胎体外操作工具制备在酒精喷灯上将玻璃管拉成直径1mm的细管，连上乳胶管即可。

2 小鼠的抓去与保定3 收集精子断颈处死公鼠，打开腹腔，找到睾丸和附睾，剪取附睾尾，剪碎，置1.5ml离心管底部，加0.5ml 生理盐水，置37度水浴锅20分钟，用吸管从离心管上部取50微升液体，置细胞计数板，观察精子结构、密度和活力。

精子活力计算公式：精子活力＝视野中直线运动的精子数/视野中总精子数4 收集卵母细胞成熟卵母细胞的收集：母鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG（每只10单位），48小时后再注射人类绒毛膜促性腺HCG（每只10单位），18小时后断颈处死母鼠，打开腹腔，剪下输卵管，用镊子刺破输卵管壶腹部，释放卵母细胞，用透明质酸酶溶液（10毫克/毫升生理盐水）处理卵母细胞以除去颗粒细胞，在实体显微镜下观察卵母细胞的结构。

未成熟卵母细胞的收集：断颈处死性成熟前母鼠，打开腹腔，剪取卵巢，加入1毫升盐水，用刀片或镊子捣碎卵巢，寻找生发泡状态的卵母细胞，观察卵母细胞结构。

5 体外授精将卵母细胞与精子共培养（微滴培养法）（演示）三、实验结果各种精子和卵子的形态绘图；精子活力；精子密度四、实验收获与体会，存在问题和改进意见。

实验二：小鼠早期不同发育阶段胚胎的收集、观察以及胚胎移植一、实验目的：掌握小鼠附植前胚胎收集方法，观察不同发育阶段小鼠胚胎的结构，认识小鼠早期胚胎形态学，并了解体内发育阶段与所处生殖器官位置的关系，了解小鼠胚胎移植的基本原理和操作过程。

二、操作过程：1 小鼠超数排卵程序中午12时腹腔注射PMSG，48小时后腹腔注射HCG并与公鼠合笼交配，次日清晨检查阴道栓，如果发现阴道栓则妊娠0.5天。

胚胎工程的操作方法胚胎工程是一种生物技术，旨在使用体外受精和体外培养的方法，以及分子生物学和遗传学技术，对胚胎进行操作和研究。

胚胎工程包括胚胎克隆、胚胎干细胞提取、基因编辑等技术，并用于生物学研究、治疗疾病等领域。

胚胎工程涉及的主要操作方法如下：一、体外受精：体外受精是胚胎工程的起点，即将精子和卵子在体外结合形成受精卵。

首先，从男性提取精子样本，然后从女性提取卵子样本。

通过实验室条件下的体外受精，将精子与卵子结合，形成受精卵。

二、胚胎培养：受精卵形成后，需要进行胚胎培养。

最常用的培养方式是将受精卵置于试管中，提供适宜的培养基，维持胚胎所需的生长条件，如温度、湿度、氧气浓度等。

通过培养，可以让胚胎继续发育，达到特定的发育阶段。

三、胚胎克隆：胚胎克隆是指将一个成熟的细胞核（核提取自器官细胞等成熟细胞）植入去核卵细胞中，形成新的胚胎。

胚胎克隆可以用于研究动物的遗传疾病、生物学发育等方面。

典型的胚胎克隆方法是核移植，即将所需细胞核提取出来，然后植入去核卵细胞内。

四、胚胎干细胞提取：胚胎在早期发育中的细胞称为胚胎干细胞（ES细胞）。

这些细胞具有多能性，可以发育成人体的各种组织和器官。

为了提取胚胎干细胞，通常从培育到一定的时点后，将胚胎的内细胞团或一部分细胞移植至体外环境，培养并分离出胚胎干细胞。

五、基因编辑：胚胎工程还包括基因编辑技术，用于改变胚胎的遗传信息。

例如，通过CRISPR-Cas9技术，可以精确地编辑胚胎的基因，纠正一些遗传缺陷或特定基因突变。

总的来说，胚胎工程涉及到体外受精、胚胎培养、胚胎克隆、胚胎干细胞提取和基因编辑等操作方法。

这些操作方法为研究生物学的发展、治疗疾病等提供了技术手段，但同样也存在着伦理和道德等方面的争议和限制。

因此，在进行胚胎工程研究时，需要遵循相关的伦理规范与法律法规，确保其在合理和可控的范围内进行。