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DNA测序技术及其应用ppt

DNA测序技术及其应用ppt

2.第一代测序技术
化学降解法
• 基本原理：利用特异的选择性试剂，
专一性的随机断裂DNA成不同长短的片 段。根据试剂的选择性及片段在高分 辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带 位置，判断DNA片段末端核苷酸的种类
，从而测出DNA的序列。
技术路线
将双链DNA样品变为单链 ↓ 每个单链的同一方向末端都用放射 性同位素标记,以便显示DNA条带 ↓ 分别用不同方法处理,获得只差 一个核苷酸的降解DNA群体 ↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序
第一代测序技术在分子生物学研究中发 挥过重要的作用,如人类基因组计划(human genome project,HGP)主要基于第一代DNA测 序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱 氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛 地应用。
2.第二代测序技术
• 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬 菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工 作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不 足，并不是最理想的测序方法。 • 随着人类基因组计划的完成，后基因组时代， 即功能基因组时代已向我们走来。第一代测序 方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规 模基因组测序的需求，这促使了第二代测序， 又称下一代测序(next—generation sequencing)的诞生。 • 第二代测序技术包括：454测序技术、Solexa测 序技术和SOLiD测序技术。
过程概述
基因组DNA
限制性内切酶酶切
DNA片段（cDNA）
片段两序
（聚合酶合成测序，连接酶合成测序）
由于所有的克隆都在同一平面上，这些反应就能够大规模平行 进行，每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行， 从而获得测序数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复，最后经过计 算机分析就可以获得完整的DNA序列信息。

DNA测序技术及发展[可修改版ppt]

DNA测序技术及发展[可修改版ppt]
经电泳分离，放射自显影，直接读出DNA 的核苷酸序列
反应体系
引物 模板：纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链
DNA DNA聚合酶：Klenow大片段 放射性同位素标记的dNTP：32P-dNTP、α-32S-
dNTP ddNTP 用于测序的变性凝胶电泳：
➢ 胶长40cm
ddNTP
DNA测序技术及发展
人类基因组计划（Human genome project, HGP） 用了大约10年的时间，各国政府相继投入了几十
亿美元，才完成了人类个体全基因组序列的测序 工作。而2005年以来，出现的新一代测序技术， 却可在1个月内，花费十几万美元就可完成一个人
类个体全基因组序列的测序工作。现在，美国、
欧洲等各大生物技术公司、大型生物医药研究机
构等投入大量的人力物力开始了新一轮的下一代 测序技术的技术竞赛，力争实现1000美元完成一
个人的全基因组序列的测序，加速个人基因组时 代的到来。
一、DNA测序技术概述
DNA测序——核酸 DNA分子一级结构 的测定，是现代分 子生物学一项重要 的技术。
➢ 核苷酸的排列顺序 ➢ 碱基的排列顺序
单分子测序技术（第三代测序）
➢ Helicos ➢ Pacific Biosciences ➢ Oxford Nanopore
代数
测序技术
特点
代表仪器
第一代 第二代 第三代
Sanger测序法 低通量，高成 ABI 3730XL 本
循环芯片技术
高通量 高效率
成本底
单分子测序 试剂用量少，成
本更低
Illumina GA ROCH-454 ABI-SOLID
HeliScope
二、 第一代测序方法

DNA及测序ppt课件

DNA及测序ppt课件

如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核 苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2ˊ,3ˊ ddNTP，那 么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展 开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。
在 4组 独 立 的 DNA合 成 反 应 中 ， 分 别 加 入 4种 不 同 的 ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终 止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对 这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。
5´
G A C T G A A G C T G T T
5´
C
T
G
A
C
T
T
C 读出待测 G
序列
A C
A
A
3´
（二）化学裂解法测序原理
用化学试剂处理末端放射性标记的 DNA片断，造成碱基的特异性切割。由此 产生的一组具有不同长度的DNA链的反应 混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自 显影之后，便可根据x光底片上所显示的 相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷 酸序列。
一、传统测序方法
（一）双脱氧链终止法(Sanger法) （二）化学裂解法（Maxam-Gilbert）
（一）双脱氧链终止法测序原理
Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸 （2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核糖 的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷 酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷 酸链的延伸终止。
如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP， 则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列 长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中， 分别加入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将 分别终止于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸 链进行高分辨变性聚CGGTAGCAACT 5´ 引物 5´ GG 3´

《DNA测序技术》课件

《DNA测序技术》课件
《DNA测序技术》PPT课 件
第一部分：DNA测序简介
了解DNA测序技术的定义、历史发展，以及应用领域。
第二部分：DNA测序的主要步 骤
探索DNA样品准备、DNA片段分离与纯化、序列反应和数据分析等关键步骤。
第三部分：DNA测序技术的类 型
介绍Sanger测序、高量测序、单分子实时测序和光学显微镜下的测序等不 同类型的DNA测序技术。
第四部分：DNA测序技术的优缺点
探讨DNA测序技术的优点，如高精度、高效性和大规模测序，以及其缺点，如成本较高和数据分析较为 困难。
第五部分：DNA测序技术的未 来展望
展望第三代测序技术的发展，测序技术在健康医疗、环境保护和农业等领域 的应用。
第六部分：结论
强调DNA测序技术在科学研究中的重要作用和其广阔的发展前景。

[课件]DNA测序技术简介PPT

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其他DNA全自动分析仪：
310型全自动遗传分析仪
ABI Prism® 3100遗传分析仪
3700型全自动遗传分析仪
安玛西亚DNA序列分析系统型号： MegaBACE 500/1000/4000
DNA测序的方法

链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序
链终止法测序(the chain termination method)

３．DNA聚合酶
通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠
杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反转录酶（见文
献，如Mieredorf和Prfeffer，1987）经过修饰消除了3'→5'外节酶活性的 T7噬菌体DNA聚合酶（Sequenase）和测序酶2.0），Tabor和Richardson，
而只是在不久前得到改进以后， 这一方法才发展到能够获得明确可信结果的 水平。其中有两个因素是至关重要的，这就是模板DNA的质量和所用DNA 聚合酶的种类。小量制备的质粒DNA常常被寡脱氧核糖核苷酸小分子、核糖
苷酸及DN鬼”带、强终止现象，以及其他假象往往使测序凝胶含混不清、 黯然失色。因此采用小量制备的质粒NDA来测定未知DNA克隆片段的序列， 并不可取。然而,这类DNA常可作为对已经通过另一方法测定的序列进行进 一步的合适模板。采用CsCl－溴化乙锭梯度平衡离心法来纯化质粒DNA，测 序的结果会好得多，但却要耗费大量的人务和物力。
4 C4GA TC TA GG T TA AT G A 3 3TA A C G T TA G A 5 G T TA G AT C 1 ATA C G T TA 3 4 2 5 TA C G T TA G A C G T TA G A C G T TA G AT G T TA G AT C 计算机分析杂交图象 并由探针的重叠情况 推导样品的核酸序列 互 补 序 列 为 ： ATA C G T TA G AT C 样 品 序 列 为 ： TAT G C A AT C TA G

《DNA测序技术》课件

《DNA测序技术》课件
准确性高，降低了测序错误率；
检测灵敏度高，能检测低浓度的变异 。
第三代测序技术的原理
利用纳米孔或高分子 膜对DNA分子进行 固定；
通过识别通过纳米孔 或高分子膜的碱基， 确定DNA序列。
对固定在膜上的 DNA分子进行单分 子测序；
第三代测序技术的应用领域
01
基因组测序
对整个基因组进行高精度测序，用 于基因组学研究；
下一代测序技术的应用领域
临床诊断
下一代测序技术在临床诊断中具有重要作 用，可用于遗传病诊断、肿瘤诊断和个性
化治疗等。
A 基因组学研究
下一代测序技术广泛应用于基因组 学研究领域，包括基因组测序、基
因突变检测、基因表达分析等。
B
C
D
农业研究
下一代测序技术可用于农业研究领域，包 括作物基因组测序、品种鉴定和育种等。
DNA的复制过程
DNA复制的起始
解旋酶解开DNA双螺旋结构，形成复制叉。
DNA复制的终止
复制完成，子链与母链分离。
DNA链的延伸
DNA聚合酶催化子链合成，新合成的DNA 与母链形成氢键。
DNA复制的意义
保证遗传信息的传递和物种的延续。
DNA测序的原理
测序技术的基本原理
通过测定DNA上特定位点的碱基序列，从 而确定DNA分子上的遗传信息。
《DNA测序技术》PPT课件
目录 CONTENTS
• DNA测序技术概述 • DNA测序技术的基本原理 • 下一代测序技术（NGS） • 第三代测序技术 • DNA测序技术的未来发展
01
DNA测序技术概述
DNA测序的定义
DNA测序是指通过一定手段测量DNA 分子中碱基的排列顺序，以揭示其遗 传信息的过程。

《DNA测序方法》课件


建库
样品处理：提取DNA，进行质量控制 片段化：将DNA切割成小片段 末端修复：修复DNA末端，增加粘性末端 接头连接：将接头连接到DNA片段上 扩增：通过PCR扩增DNADNA，进行PCR 扩增
测序反应：将 PCR产物与测序 引物混合，加入 测序试剂
研究人类起源和迁徙：DNA测序可 以帮助科学家了解人类起源和迁徙 的历史，以及人类如何适应不同的 环境和文化。
DNA测序面临的挑战和未来发展方向
技术挑战：提高测序速度和准确性，降低成本
伦理挑战：保护个人隐私和数据安全
应用挑战：如何将测序技术应用于实际场景，如医疗、农业、环境等领域 未来发展方向：开发新型测序技术，如单分子测序、纳米孔测序等，提高测序效率和准确性；加强数据 管理和分析，提高数据可用性和价值；推动测序技术在更多领域的应用，如精准医疗、个性化教育等。
在生物进化研究中的应用
研究物种起源和演化：通过DNA测 序，可以了解不同物种之间的亲缘 关系和演化路径。
研究物种适应性：通过DNA测序， 可以了解物种如何适应环境变化， 以及这些适应性是如何通过基因突 变和自然选择实现的。
添加标题
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研究基因突变和自然选择：DNA测 序可以帮助科学家了解基因突变和 自然选择的过程，以及它们对生物 进化的影响。
复制起点：DNA复制的起始点，由DNA'， 即从DNA的5'端开始，向3'端延伸
复制方式：DNA复制是半保留复制，即 新合成的DNA分子中，一条链是母链， 另一条链是新合成的
复制终止：DNA复制的终止点，由DNA 聚合酶识别并终止复制
复制结果：DNA复制的结果是生成两个 完全相同的DNA分子，每个分子都包含 原来的DNA分子的全部信息

《DNA测序技术》PPT课件 (2)

• ③在农业方面，大量的改变基因组实验可能培育出大量的 对人体产生危害的变异物种，而且致病性的潜伏期也很难 确定。
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• 人类基因组计划(human genome project,
HGP)是由美国科学家于1985年率先提出， 于1990年正式启动的。美国、英国、法国、 德国、日本和我国科学家共同参与了这一 预算达30亿美元的人类基因组计划。按照 这个计划的设想，在2015年，要把人体内 约4万个基因的密码全部解开，同时绘制出 人类基因的谱图。
• 四个月后的2014年6月30日，食药总局批准了二代基因测 序产品上市。其中，华大基因的两款测序仪和试剂盒通过 审批。
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临床测序
• 按照行业分析的结果，市场基本被华大基 因（BGI）、贝瑞和康 （BERRYGENOMICS）、安诺优达 （ANNOROAD）三家公司所占领，
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• 利用新一代DNA测序技术，可以高效，廉 价地测定所钉重要农业生物的基因组序列， 测定农业核心种质的基因组序列，全面了 解农作物遗传变异情况，进而大规模地鉴 定、克隆功能基因。基于新一代DNA测序 技术的种质基因组学，将实现农业育种由 经验依赖型向知识决定型的转变，给农业 发展带来革命。
7
第二代
• 80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱 氧终止法原理）、荧光代替同位素，计算 机图象识别
• 90年代中期，测序仪重大改进、集束化的 毛细管电泳代替凝胶电泳
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8
DNA序列分析的自动化原理
• 利用双脱氧末端终止法的原理，用四种不 同的荧光化合物分别标记4种反应产物，把 4种反应物混合在一起进行电泳，从而大大 提高点用分析的效率，实现了DNA测序的 高度自动化。
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A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性
B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
5ˊP 3ˊHO 制备单链DNA 5ˊP
OH 3ˊ P 5ˊ OH 3ˊ
加放射性引物
而只是在不久前得到改进以后， 这一方法才发展到能够获得明确可信结果的 水平。其中有两个因素是至关重要的，这就是模板DNA的质量和所用DNA 聚合酶的种类。小量制备的质粒DNA常常被寡脱氧核糖核苷酸小分子、核糖
苷酸及DNห้องสมุดไป่ตู้聚合酶的抑制剂所污染，其中前两种污染物可被用作随机引物。
结果，种种“鬼”带、强终止现象，以及其他假象往往使测序凝胶含混不清、 黯然失色。因此采用小量制备的质粒NDA来测定未知DNA克隆片段的序列， 并不可取。然而,这类DNA常可作为对已经通过另一方法测定的序列进行进 一步的合适模板。采用CsCl－溴化乙锭梯度平衡离心法来纯化质粒DNA，测 序的结果会好得多，但却要耗费大量的人务和物力。
从下到上依次读出DNA 片段的核苷酸序列
Sanger法DNA测序的试剂

１．引物
酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的
合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。在许多情况下，可 将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单 链DNA分子作为模板。 都可以采用能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火 的通用引物，而不必取得与未知DNA序列互补的引物。

ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3' 位置缺少一个羟 基。它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5' 三磷酸基团掺入到正在增 长的DNA链中，但由于没有3'羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸 二酯链，因此，正在增长的DNA链不可能继续延伸。这样，在DNA 合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后， 链延伸 将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的 核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早
5ˊP HO DNA聚合酶， dATP，dTTP， dGTP，dCTP OH 3ˊ P32 5ˊ
ddGTP
ddATP
ddTTP
ddCTP
聚合产物分别在 4个泳道电泳
ddGTP 5 ˊ 32P -GTCATGTGCTAG 5 ˊ 32P 5 ˊ 32P 5 ˊ 32P 5 ˊ 32P 5 ˊ 32P 5 ˊ 32P 5 ˊ 32P 5 ˊ 32P 5 ˊ 32P 5 ˊ 32P 5 ˊ 32P GTCATGTGCTA GTCATGTGCT GTCATGTGC GTCATGTG GTCATGT GTCATG GTCAT GTCA GTC GT G ddATP ddTTP ddCTP

２．模板 有两类DNA可以用作Sanger 法测序的模板：纯单链DNA和经过热变性 或碱变性的双链DNA。 采用通常从重组M13噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA应中获得数百个 核苷酸的序列。如用变性双链DNA用模板，则较难获得高质量的结果。尽管
采用双链DNA模板的方法显然既简单又方便（Chen和Seeburg，1985），然
DNA测序技 术简介
人类基因组计划（Human Genome Project －HGP）于1990年正式启动，其主要目标有： 识别人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定 组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息 储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致 力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问 题。 人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的 科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代 医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大 意义和商业上的巨大价值。
中国的HGP起步较晚, 但中国人口众多,有56 个民族和许多遗传隔离群, 拥有世界上最丰富的 遗传家系资源, 对于研究HGP的重要目标之一— —人类遗传的多样性正具有得天独厚的优势。 拥有一批国家重点实验室及专业齐备的科研 力量, 因此可以根据HGP的目标, 结合中国的特点 开展研究。 1999年7月，我国在国际人类基因组注册， 承担了其中1％的测序任务，此举标志着我国已 掌握生命科学领域中最前沿的大片段基因组测序 技术，在结构基因组学中占了一席之地。

分析仪器的新发展：
377型遗传分析仪 377 型DNA 全自动测序仪采用经典的聚丙烯酰胺凝胶的电泳 方式, 结合美国应用生物系统公司专利的四色荧光标记, 激光检测, 一个泳道检测的方法, 具有测序结果准确性好, 精度高, 操作简便 快速等特点, 已成为全球应用最多最广泛的全自动DNA 测序仪之 一。
链终止的位置之间的距离。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的
ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一 个A、每一个G或每一个T的位置上。
生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷 酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止 于特定的一种或者多种残基上。 由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的 机会均等，因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸 混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在 原DNA全片段上的位置所决定。 在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分 子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要 把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳 道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上 的核苷酸顺序。
其他DNA全自动分析仪：
310型全自动遗传分析仪
ABI Prism® 3100遗传分析仪
3700型全自动遗传分析仪
安玛西亚DNA序列分析系统型号： MegaBACE 500/1000/4000
DNA测序的方法

链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序
链终止法测序(the chain termination method)
氧脱 核氧 苷核 酸甘 结酸 构与 比双 较脱
少一个－OH
技术路线与要求
制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸
A 高酶活性
B 无5’→3´外切酶活性 C 无3´→5´外切酶活性 ddATP/ddCTP/ddGTP/ ddTTP 的3’碳原子连接 的是氢原子,不是羟基