伪狂犬病检测方法

山东畜牧兽医2017年第38卷伪狂犬病毒的分离鉴定姚红（山东省东平县畜牧兽医局 271500）摘要 本研究对疑似伪狂犬病猪的病料进行分离鉴定，通过细菌学鉴定、病毒提取培养、电镜观察、动物试验和中和试验。

结果表明，所取病料分离鉴定出伪狂犬病毒。

关键词伪狂犬病毒分离鉴定中图分类号：S852.65+5 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2017)12-0016-02猪的伪狂犬病是由狂犬病病毒(PRV)引起的一种危害严重的急性败血性传染病，主要以新生仔猪的急性死亡及4周龄以上的仔猪表现神经病状为特征。

1 材料及方法1.1 材料1.1.1 病料在周边猪场采集临床表现有发热、昏迷、神经症状等症状的疑似伪狂犬病的死猪中，在脑部取样。

细胞株猪肾传代细胞(PK-15)，由吉林大学畜牧兽医学院病理实验室保存。

1.1.2 主要试剂健康猪的经脉血液，采自附近猪场；葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、枸橼酸、氯化钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、无水乙醇、青霉素、链霉素、酚红、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)粉剂；胰蛋白酶，购自长春宝泰克生物制品有限责任公司；胎牛血清(FCS)，购自中国医学科学院血液学研究所。

1.1.3 主要器材各型微量可调移液器、生物显微镜、96孔培养板、WZ-2A微量振荡器、DK-8D型电热恒温箱、PCR扩增仪(Gene Amp PCR System 9600,Biometra)、TY600C型电泳仪、电泳槽，凝胶成像系统，70P-72型超速离心机，DW-40L262型立式医用冰箱，GZX-9070 MBE 数显鼓风干燥箱，BS124S型电子分析天平，DL-CJ-IN型超净工作台，MCO-17AI型CO2培养箱，JEM-1200EXII投射电子显微镜，数码照相机，一次性滤器(仪器精密度为0.22µm)。

1.1.4 各种溶液的配制DMEM营养液的配制、D-Hanks 液的配制、0.25%的胰酶的配制、PBS液的配制、革兰氏染色液的配制(结晶紫溶液、(路)卢戈碘液、脱色剂、番红花红染色液)，以上液体由试验组配制完成。

2020.3作者简介:张晓亭(1982-),男,河南省许昌市人,兽医师,研究方向:动物疫病防控。

两种检测猪伪狂犬病gB 抗体方法比较张晓亭(河南省许昌市建安区动物疫病预防控制中心461000)摘要:为评价化学发光免疫分析法在临床检测猪伪狂犬病gB 抗体中的适用性,将其与IDEXX 公司ELISA 抗体检测方法进行比对试验。

对110份猪血清进行猪伪狂犬病gB 抗体化学发光免疫分析法与ELISA 法的检测。

结果显示,以ELISA 法为标准,化学发光免疫分析法检测猪伪狂犬病gB 抗体的灵敏度、特异性、符合率分别为98.31%、100%、99.10%,Kappa=0.96,说明化学发光免疫分析法与ELISA 法的符合率较高,且其操作步骤更简便,更省时,可以用于临床猪血清样品的猪伪狂犬病gB 抗体的检测。

关键词:猪伪狂犬病gB ;抗体;方法;比较猪伪狂犬病(Pseudorabies)是由猪伪狂犬病病毒(Pseu⁃dorabies virus,PrV)引起的可致妊娠母猪流产、种公猪不育、育肥猪生长停滞、仔猪死亡的一种急性传染病[1]。

一旦猪场发生该病,将给养殖户带来巨大的经济损失。

目前还没有有效的方法治疗该病,疫苗免疫接种是预防与控制该病的根本措施。

而血清抗体水平检测可以反映出猪群的免疫抗体水平,对猪场免疫程序的制订具有一定指导意义[2]。

目前,国标上推荐的方法依然是ELISA,ELISA 方法具有快速、简便、特异性好等优点,是当前常用的适合大规模应用的抗体检测方法。

化学发光免疫分析法结合了抗体免疫方法与化学发光技术,其灵敏度更高,已广泛应用于医学、环境监测、食品检测等方面。

为了解化学发光免疫分析法在检测猪伪狂犬病gB 抗体方面的应用价值,本实验将某国产猪伪狂犬病病毒gB 化学发光抗体检测试剂盒(化学发光免疫分析法)与美国IDEXX 公司生产的猪伪狂犬病病毒gB 抗体ELISA 检测试剂盒进行比较分析,以期为临床猪血清样品猪伪狂犬病gB 抗体的检测寻找更为简便、快速且准确的检测方法。

PCR快速检测伪狂犬病病毒野毒感染周斌;苏鑫铭;张素芳;贾赟;曹瑞兵;陈溥言【期刊名称】《中国病毒学》【年(卷),期】2004(019)006【摘要】根据已发表的伪狂犬病病毒(PrV)gE、gI基因的序列,设计并合成了一对引物,以PrV容A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件和试剂工作浓度,建立了区分PrV野毒株和疫苗弱毒的鉴别PCR方法.该方法能从PrV容A株(RA)、上海株(SH)、鲁A株(LA)中扩增出一条848bp的片段,但Bartha-K61株没有扩增出该片段.测序结果表明PCR扩增产物和方法的特异性.对正常细胞与其它6种引起猪病毒性疫病相关病毒进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应.对PrV容A株细胞毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为5pg.PCR对感染野毒的发病猪不同组织器官检测发现,淋巴结检出率最高,依次为脾、脑(海马角)、肺、肾、肝等.对2003～2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的37个大中型猪场送检的172份病料进行PCR检测病料阳性率为20.34%(35/172),猪场阳性率为40.54%(15/37).实验结果表明所建立的PCR技术可用于伪狂犬病野毒感染的快速鉴定和流行病学调查.【总页数】4页(P612-615)【作者】周斌;苏鑫铭;张素芳;贾赟;曹瑞兵;陈溥言【作者单位】南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】R373.9【相关文献】1.鉴别伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒荧光定量PCR方法的建立 [J], 赵丽;崔保安;陈红英;魏战勇;郑兰兰;吕晓丽;贾艳艳;赵绪永2.鉴别猪伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒双重PCR检测方法的建立 [J], 赵丽;卢婷婷;李存法;陈忠杰;连瑞丽3.鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用 [J], 赵雪丽;闫若潜;吴志明;曹伟伟;王淑娟;谢彩华;马震原;周兵强;王东方4.伪狂犬病病毒野毒感染快速检测方法的比较 [J], 杨红杰;李雪明;于红欣;邹战明;杨倩;周双海5.猪伪狂犬病病毒野毒LNA探针real-time PCR检测方法的建立 [J], 李艳;李春玲;楚品品;雷雯;勾红潮;蒋智勇;蔡汝健;宋帅;卞志标;杨东霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

十一、伪狂犬病检测方法伪狂犬病病毒分离鉴定1 材料准备DMEM培养基、 BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、培养箱、倒置显微镜。

溶液配制见附录0.22ul微孔滤膜、细胞培养瓶、 CO2A(标准的附录)2 操作步骤2.1病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物, 无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织, 特别是三叉神经节、嗅球, 4℃送实验室检测。

2.2样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎, 加入灭菌玻璃砂研磨, 用灭菌生理盐水或DME培养基制成1: 5乳剂, —70℃重复冻融后, 经3000rpm离心30分钟后, 取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后, 加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL, —70℃保存作为接种材料。

2.3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞, 接种量为培养基量的10%, 37℃恒温箱中吸附1小时后, 加入含10%新生犊牛血清( 经过56℃水浴灭活30分钟, 过滤除菌, 无支原体) 的DMEM培养基, 置37℃温箱中培养。

2.4观察结果接种后24—48小时, BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应( Cyto pathogenic effect, CPE) , 表现为细胞变圆, 脱落。

如第一次接种不出现CPE, 应将细胞培养物冻融后盲传三代, 如仍无CPE, 则判为伪狂犬病病毒阴性。

2.5病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物重复冻融后, 用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。

伪狂犬病聚合酶链式反应1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K, 十二烷基磺酸钠( SDS) , 苯酚、氯仿, 异戊醇( 分析纯) 、 TEN缓冲液。

溶液配制见附录C(标准的附录)引物: 扩增伪狂犬病病毒基因中434—651bp之间217bp基因片段, 由上海生物工程公司合成。

序列为, 上游引物P1: 5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’,下游引物P2: 5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3仪器设备有: 凝胶电泳紫外线检测仪, PCR扩增仪, 电泳仪2操作步骤:2．1 样品的采集: 对于病死或扑杀动物, 取脑组织; 对于待检活猪, 用已灭菌的棉签, 伸入猪鼻腔中, 采取鼻粘液, 即为鼻拭子, 冷藏条件送实验室检测。

猪伪狂犬病的诊断与鉴别方法猪伪狂犬病是由狂犬病毒V系病毒引起的一种新型狂犬病，也被称为马钩菌性狂犬病或伪狂犬病。

猪伪狂犬病在亚洲、欧洲、南美洲等猪养殖区已经成为一种普遍的疾病，对猪养殖业造成了严重的经济损失。

本文将系统地介绍猪伪狂犬病的诊断与鉴别方法。

病原学猪伪狂犬病是一种DNA病毒感染病，其病原体狂犬病毒V系病毒与狂犬病毒同属于家畜及人类中较为常见的病毒。

传染源主要是疑似或确诊养猪场中的猪，且其唾液、尿液、粪便、血液等各种体液均可携带病毒。

病原体可通过直接接触、飞沫传播、皮肤和黏膜等途径进入寄主体内，并在体内大量繁殖、扩散，引起机体免疫反应，影响猪的生长发育，甚至导致死亡。

临床表现猪伪狂犬病的临床症状多样，主要表现为猪的食欲下降、体重下降、行走困难、神经兴奋症状等。

此外，病猪也会表现出食欲旺盛、睡眠质量变差、牙齿外露、鼻唇积液、呼吸急促、害怕光照等症状。

在发病初期，猪伪狂犬病与其他家畜疾病症状十分相似，因此在早期诊断十分困难。

诊断方法猪伪狂犬病的诊断一般采用病理学检查、血清学检查、分子学检查等综合方法。

下面将分别介绍这些检查方法。

病理学检查通过对猪的死亡组织和脑组织进行病理学检查，可发现神经元减少、神经胶质细胞增生、神经元胞质空泡变性、细胞核固缩等特征性改变，有助于病理学诊断猪伪狂犬病。

血清学检查猪伪狂犬病的血清诊断主要是通过血清学检测法进行的。

病毒单克隆抗体可以与感染的病毒结合形成免疫复合物，通过酶标记法、荧光标记法、金标记法等将免疫复合物依次检测、染色和检视，从而确定猪是否感染猪伪狂犬病毒。

分子学检查猪伪狂犬病的分子学检测方法主要是通过PCR技术对病毒核酸进行扩增和分析，以确认病猪体内是否存在病毒。

PCR技术检测猪伪狂犬病的敏感性和特异性都比较高，因此其检测结果较为可靠。

鉴别方法鉴别猪伪狂犬病的方法主要是通过病型鉴别、病原学鉴别、血清学鉴别、分子学鉴别等多种方法进行筛选。

下面将分别介绍这些鉴别方法。