伪狂犬病检测方法

• 阳性血清：用于伪狂犬病胶乳凝集试验抗 定性试验： 取被侧样品（血清或全血）、阳性血清、阴性血清、稀释液各1滴（约20μl），分别置于波偏上，各加等量胶乳抗原1滴，
混匀，搅拌并摇动1-2分钟，在3-5分钟内观察。
原效价测定和胶乳凝集试验阳性对照。 达到阳性凝集反应的血清最高稀释倍数，即为血清的抗体效价。
阴性对照： 阴性血清加等量抗原，应不发生凝集反应。 ++++全部胶乳凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明。 乳胶抗原、阳性血清、阴性血清、稀释液。
• 阴性血清： 用于伪狂犬病胶乳凝集试验阴 -液滴呈原有的均匀乳状。
++约50%胶乳凝集，但颗粒较细，液体较浑浊
性对照。 +有少许凝集，液体呈浑浊。
胶头滴管、牙签、玻璃片。 稀释液 ：用于待检血清的稀释。
• 定量试验： 先将被测样品在微量反应板
出现“或++”以小上凝集试判为阳管性。 内用稀释液作2倍系列稀释，各
++约50%胶乳凝集，但颗粒较细，液体较浑浊
取1滴（约20μl）依次滴加于玻片上，同 +有少许凝集，液体呈浑浊。
+++大部分胶乳凝集，颗粒明显，液体稍浑浊。 ++约50%胶乳凝集，但颗粒较细，液体较浑浊
• 阳性对照： 将阳性血清进行2倍系列稀释，取 20μl与等量胶乳抗原进行胶乳凝集试验，胶乳抗 原与1：64稀释的阳性血清应出现“++”凝集反应。
• 阴性对照： 阴性血清加等量抗原，应不发生凝集 反应。
• 稀释液对照： 抗原加稀试验： 取被侧样品（血清或全 血）、阳性血清、阴性血清、稀释液 各1滴（约20μl），分别置于波偏上， 各加等量胶乳抗原1滴，混匀，搅拌并 摇动1-2分钟，在3-5分钟内观察。判 定结果。

山东畜牧兽医2017年第38卷伪狂犬病毒的分离鉴定姚红（山东省东平县畜牧兽医局 271500）摘要 本研究对疑似伪狂犬病猪的病料进行分离鉴定，通过细菌学鉴定、病毒提取培养、电镜观察、动物试验和中和试验。

结果表明，所取病料分离鉴定出伪狂犬病毒。

关键词伪狂犬病毒分离鉴定中图分类号：S852.65+5 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2017)12-0016-02猪的伪狂犬病是由狂犬病病毒(PRV)引起的一种危害严重的急性败血性传染病，主要以新生仔猪的急性死亡及4周龄以上的仔猪表现神经病状为特征。

1 材料及方法1.1 材料1.1.1 病料在周边猪场采集临床表现有发热、昏迷、神经症状等症状的疑似伪狂犬病的死猪中，在脑部取样。

细胞株猪肾传代细胞(PK-15)，由吉林大学畜牧兽医学院病理实验室保存。

1.1.2 主要试剂健康猪的经脉血液，采自附近猪场；葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、枸橼酸、氯化钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、无水乙醇、青霉素、链霉素、酚红、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)粉剂；胰蛋白酶，购自长春宝泰克生物制品有限责任公司；胎牛血清(FCS)，购自中国医学科学院血液学研究所。

1.1.3 主要器材各型微量可调移液器、生物显微镜、96孔培养板、WZ-2A微量振荡器、DK-8D型电热恒温箱、PCR扩增仪(Gene Amp PCR System 9600,Biometra)、TY600C型电泳仪、电泳槽，凝胶成像系统，70P-72型超速离心机，DW-40L262型立式医用冰箱，GZX-9070 MBE 数显鼓风干燥箱，BS124S型电子分析天平，DL-CJ-IN型超净工作台，MCO-17AI型CO2培养箱，JEM-1200EXII投射电子显微镜，数码照相机，一次性滤器(仪器精密度为0.22µm)。

1.1.4 各种溶液的配制DMEM营养液的配制、D-Hanks 液的配制、0.25%的胰酶的配制、PBS液的配制、革兰氏染色液的配制(结晶紫溶液、(路)卢戈碘液、脱色剂、番红花红染色液)，以上液体由试验组配制完成。

３ 讨 论 ８月份 免疫 抗体 结 果 显示 ， 猪 场猪 伪 狂犬 病 该
规 模 莽 猪
关， 即养 殖 密 度小 、 养 环境 优 良 、 饲 免 疫 措 施 到 位 ， 毒 严 格 的 猪 场 ， 伪 消 猪
毒ｇ Ｂ抗 体 、 瘟 抗体 、 蓝耳 病 抗 体合 格 率 较低 ， 猪 猪
一
方 面 ． 是 造 成 猪群 生 殖 一 吸综 合 征 的元 凶之 也 呼
。
１ １月份 ， 正值 秋 防 时期 ， 过 调整 本 猪场 免 也 通 疫 剂 量 和首 免 日龄等 免 疫 程序 ，并 及 时改 善 饲 养
管 理 ． 对 本 猪 场 进 行 猪 伪 狂 犬 病 、 瘟 、 蓝 耳 又 猪 猪 病 免 疫 抗 体 进 行 监 测 ， 果 显 示 ， 整 后 ， 群 猪 结 调 猪 伪狂 犬 病抗 体 、 瘟 抗体 、 蓝耳 病 免 疫抗 体 均 有 猪 猪
１ ． 清 被 检 ｍ清 样 品共 ３ ２份， ６个规 １血 ５ 由
模 化猪 场提 供 。
１ ． 测试 剂 猪 伪 狂犬 病 毒 ｇ｛ 体 试 剂 ２检 Ｉ抗 盒 、 伪 狂 犬病 毒 ｇ ｌ 体 试 剂 盒 、 瘟抗 体 检 猪 ｐ抗 猪
测 试 剂 盒 、 猪 蓝 耳 病 抗 体 检 测 试 剂 盒 均 由 美 围
一
故猪 伪 狂犬 病 的预 防 和控制 尤 为重要 。
４小 结
ＰＲＲＳ＋Ｐ Ｒ＋ ＣＳＦ ６ ７
３
４． ５
５５
２
３． ６
表 １猪 伪 狂 犬 病 、 瘟 、 蓝 耳 病 抗 体 监 测 结果 猪 猪
（ 单位 ： 、 头 ％）
｜ －１
一
２ ０ 年 第 ３期 ０ ８

03
核酸检测：检测病 毒核酸
05
免疫学检测：检测 免疫反应
02
血清学检测：检测 血清中的抗体
04
病原学检测：检测 病原体
06
病理学检测：检测 组织病理变化
鉴别方法
与其他猪病的鉴别
猪瘟：猪伪狂犬病与 猪瘟的症状相似，但 猪瘟的体温升高更为 明显，且病程较短。
01
猪链球菌病：猪伪狂 犬病与猪链球菌病的 症状相似，但猪链球 菌病通常伴有关节肿 胀和疼痛。
猪伪狂犬病的诊断与鉴别方法
演讲人
目录
01. 诊 断 方 法 03. 防 治 措 施
02. 鉴 别 方 法
诊断方法
临床症状观察
1 体温升高：猪体温升高至40-42摄氏度 2 神经症状：猪出现共济失调、转圈、抽搐等神经症状 3 呼吸困难：猪呼吸急促，呼吸困难 4 皮肤症状：猪皮肤出现红斑、丘疹等皮肤症状 5 腹泻：猪出现腹泻，粪便呈水样或糊状 6 死亡：猪在出现症状后，可能迅速死亡
实验室检测：采集病料进行实验室检测，如病毒分 离、血清学检测等
鉴别诊断：根据临床症状、病理学检查和实验室检 测结果，进行综合分析，确定猪伪狂犬病的诊断
防治措施
疫苗接种
疫苗种类：灭活疫 1 苗、弱毒疫苗、基 因工程疫苗等
接种对象：猪群
2
接种时间：根据猪 3 场实际情况制定合 理的免疫程序
接种方法：肌肉注 4 射、皮下注射等
注意事项：疫苗保 5 存、接种剂量、接 种后观察等
加强 持适宜的温度
和湿度
2020
严格执行防疫 制度，防止病 原体传入猪场
2022
01
02
03
04
05
保持猪舍清洁、 干燥，定期消

2020.3作者简介:张晓亭(1982-),男,河南省许昌市人,兽医师,研究方向:动物疫病防控。

两种检测猪伪狂犬病gB 抗体方法比较张晓亭(河南省许昌市建安区动物疫病预防控制中心461000)摘要:为评价化学发光免疫分析法在临床检测猪伪狂犬病gB 抗体中的适用性,将其与IDEXX 公司ELISA 抗体检测方法进行比对试验。

对110份猪血清进行猪伪狂犬病gB 抗体化学发光免疫分析法与ELISA 法的检测。

结果显示,以ELISA 法为标准,化学发光免疫分析法检测猪伪狂犬病gB 抗体的灵敏度、特异性、符合率分别为98.31%、100%、99.10%,Kappa=0.96,说明化学发光免疫分析法与ELISA 法的符合率较高,且其操作步骤更简便,更省时,可以用于临床猪血清样品的猪伪狂犬病gB 抗体的检测。

关键词:猪伪狂犬病gB ;抗体;方法;比较猪伪狂犬病(Pseudorabies)是由猪伪狂犬病病毒(Pseu⁃dorabies virus,PrV)引起的可致妊娠母猪流产、种公猪不育、育肥猪生长停滞、仔猪死亡的一种急性传染病[1]。

一旦猪场发生该病,将给养殖户带来巨大的经济损失。

目前还没有有效的方法治疗该病,疫苗免疫接种是预防与控制该病的根本措施。

而血清抗体水平检测可以反映出猪群的免疫抗体水平,对猪场免疫程序的制订具有一定指导意义[2]。

目前,国标上推荐的方法依然是ELISA,ELISA 方法具有快速、简便、特异性好等优点,是当前常用的适合大规模应用的抗体检测方法。

化学发光免疫分析法结合了抗体免疫方法与化学发光技术,其灵敏度更高,已广泛应用于医学、环境监测、食品检测等方面。

为了解化学发光免疫分析法在检测猪伪狂犬病gB 抗体方面的应用价值,本实验将某国产猪伪狂犬病病毒gB 化学发光抗体检测试剂盒(化学发光免疫分析法)与美国IDEXX 公司生产的猪伪狂犬病病毒gB 抗体ELISA 检测试剂盒进行比较分析,以期为临床猪血清样品猪伪狂犬病gB 抗体的检测寻找更为简便、快速且准确的检测方法。

PCR快速检测伪狂犬病病毒野毒感染周斌;苏鑫铭;张素芳;贾赟;曹瑞兵;陈溥言【期刊名称】《中国病毒学》【年(卷),期】2004(019)006【摘要】根据已发表的伪狂犬病病毒(PrV)gE、gI基因的序列,设计并合成了一对引物,以PrV容A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件和试剂工作浓度,建立了区分PrV野毒株和疫苗弱毒的鉴别PCR方法.该方法能从PrV容A株(RA)、上海株(SH)、鲁A株(LA)中扩增出一条848bp的片段,但Bartha-K61株没有扩增出该片段.测序结果表明PCR扩增产物和方法的特异性.对正常细胞与其它6种引起猪病毒性疫病相关病毒进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应.对PrV容A株细胞毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为5pg.PCR对感染野毒的发病猪不同组织器官检测发现,淋巴结检出率最高,依次为脾、脑(海马角)、肺、肾、肝等.对2003～2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的37个大中型猪场送检的172份病料进行PCR检测病料阳性率为20.34%(35/172),猪场阳性率为40.54%(15/37).实验结果表明所建立的PCR技术可用于伪狂犬病野毒感染的快速鉴定和流行病学调查.【总页数】4页(P612-615)【作者】周斌;苏鑫铭;张素芳;贾赟;曹瑞兵;陈溥言【作者单位】南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】R373.9【相关文献】1.鉴别伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒荧光定量PCR方法的建立 [J], 赵丽;崔保安;陈红英;魏战勇;郑兰兰;吕晓丽;贾艳艳;赵绪永2.鉴别猪伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒双重PCR检测方法的建立 [J], 赵丽;卢婷婷;李存法;陈忠杰;连瑞丽3.鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用 [J], 赵雪丽;闫若潜;吴志明;曹伟伟;王淑娟;谢彩华;马震原;周兵强;王东方4.伪狂犬病病毒野毒感染快速检测方法的比较 [J], 杨红杰;李雪明;于红欣;邹战明;杨倩;周双海5.猪伪狂犬病病毒野毒LNA探针real-time PCR检测方法的建立 [J], 李艳;李春玲;楚品品;雷雯;勾红潮;蒋智勇;蔡汝健;宋帅;卞志标;杨东霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

廖 冰麟
摘
福 州市 动物 园管 理处
３ ０ ０ ５０ ５
要 酵 母 细 胞 壁 是 从啤 酒 酵母 中提 取 的 全 天 然绿 色添 加 剂 ． 动 物 的 免 疫 功 能有 促 进 作 用 ， 动 物 生 产 中 已经 得 到 广泛 的 对 在
应用． 并取 得 良好 的 效 果 。 文 中主 要 综 述 酵母 细 胞 壁 的 主 要 结 构 和 功 能 ， 以及 酵 母 细 胞 壁 在 畜 禽 和 水 产 动 物 生 产 中 的应 用
幅 建 畜牧 兽 医
第３ ３卷
第 ２期
２ １ 年 ０１
不 同方法测定伪狂犬病活疫苗病毒含量 的对 比试验
陈 景容 陈舁生 赵 华娥
关键 词 疫 苗 病 毒 含 量
文 章 编 号 ：０ ３ ４ ３ （ ０ １ ０ — ０ ２ ０ １０ — ３ １２ １ ）２ ０ ２ — ２
福州大北 农生 物技 术有 限公 司 福州 ３ ０ １ ５０ ４
摘 要 分 别采 用 ２ ４孔 细胞 培 养 板 和 １ ０ｍＬ细胞 培 养瓶 ， 不 同条件 下培 养 病毒 来检 测 比 较伪 狂 犬病 活 疫 苗病 毒 含 量 。 在
文 献 标 识码 ： Ａ
伪狂 犬 病 （ｓｕ ｏａ ｉｓ， Ｒ；又 名 Ａ ｉ ｚｙ Ｐｅ ｄ ｒｂｅ Ｐ ｕｅ ｋ ＇ ｓ ｓ
以细胞 产生 病变 为判 断标准 。 据 Ｋ ｒｅ 法 计 根 ａｂｒ
算 Ｔ Ｉ 结 果见表 １ ＣＤ 。 ４ 讨论 与小 结
１ 细 胞 由济南 斯 帕法斯 公 司购买 的 Ｓ Ｆ种 蛋孵 ． ３ Ｐ
表 １ 不 同培 养方 法 及 条件 下的 检 测 结果
化的 １ １日龄鸡胚 制备而 成 。

十一、伪狂犬病检测方法伪狂犬病病毒分离鉴定1 材料准备DMEM培养基、 BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、培养箱、倒置显微镜。

溶液配制见附录0.22ul微孔滤膜、细胞培养瓶、 CO2A(标准的附录)2 操作步骤2.1病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物, 无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织, 特别是三叉神经节、嗅球, 4℃送实验室检测。

2.2样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎, 加入灭菌玻璃砂研磨, 用灭菌生理盐水或DME培养基制成1: 5乳剂, —70℃重复冻融后, 经3000rpm离心30分钟后, 取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后, 加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL, —70℃保存作为接种材料。

2.3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞, 接种量为培养基量的10%, 37℃恒温箱中吸附1小时后, 加入含10%新生犊牛血清( 经过56℃水浴灭活30分钟, 过滤除菌, 无支原体) 的DMEM培养基, 置37℃温箱中培养。

2.4观察结果接种后24—48小时, BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应( Cyto pathogenic effect, CPE) , 表现为细胞变圆, 脱落。

如第一次接种不出现CPE, 应将细胞培养物冻融后盲传三代, 如仍无CPE, 则判为伪狂犬病病毒阴性。

2.5病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物重复冻融后, 用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。

伪狂犬病聚合酶链式反应1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K, 十二烷基磺酸钠( SDS) , 苯酚、氯仿, 异戊醇( 分析纯) 、 TEN缓冲液。

溶液配制见附录C(标准的附录)引物: 扩增伪狂犬病病毒基因中434—651bp之间217bp基因片段, 由上海生物工程公司合成。

序列为, 上游引物P1: 5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’,下游引物P2: 5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3仪器设备有: 凝胶电泳紫外线检测仪, PCR扩增仪, 电泳仪2操作步骤:2．1 样品的采集: 对于病死或扑杀动物, 取脑组织; 对于待检活猪, 用已灭菌的棉签, 伸入猪鼻腔中, 采取鼻粘液, 即为鼻拭子, 冷藏条件送实验室检测。

．
ｍｅｈ ｄ ｗａ ｏ １ ｘ ０ ． ｘ １ １ ｏ ｉｓｗｉ ｅ ｌｗｅ ｔ ｅｅ ｔｂ ｅＤＮＡ ｍ ｉ ｏ ４ ｃ ｐ ｅ ． ｉ ｒｐ ｄ ａ ｄ ｔ ｏ ｓｆ ｍ ． １ ２ ｔ １０ ０ ０ ｃ ｐ ｅ ｔ ｔ ｒ ０ ｏ ｈ ｈ ｏ ｓ ｔｃ ａ ｌ ｄ ｌ ｔ ｆ ｏ ｉｓ Ｔ ｓ ａ ｉ ｎ ｉ ｈ ｓ ｎ ｉ ｖ Ｐ ｅ ｔｃ ｕ ｄ ｂ ｕ ｎ ｏ ｒ ｔ ｃ ｕ ｒ ｅ ｒ ｓ ｌ ． ｔ ｓ ｅ ｉ ｃ ｔ ｂ ｅｅ ｔ ｇ １ ｌ ｔ ｉ ｓｏ ｅ ｓ ｉｅ ｑ ＣＲ ｔ ｓ ｏ ｌ ｅｒ ｎ ｉ ｏ ｅ ｈ ｕ ｏ ａ ｑ ｉ ｔ ｅ ｕ ｔ Ｉｓ ｐ ｃｆ ｉ ｔ ｎ ｅｈ ｓ ｉ ｙ ｙ ｄ ｔｃ ｉ ｗｉ ｓｒ ｎ ｆ ｎ ３ ｄ ａ ｐ ｅ ｄ ｒ ｂｅ ｉ ｓ ｓｉｏ ａ ｅ ｕ ａ ｏ ａｏ ｙ ｗａ ｏ ｆ ｍｅ ｉｈ ｎ ｎ ｏ ｉ ｖ ｍｐ ｉ ｃ ｔ ｎ ｆ ｒ ｓ ｎ ｓ ｕ ｏ ａ ｉ ｓｖ ｒ ｅ ｓ ｌｔｄ ｉ ｏ ｒ ｌｂ ｒ ｔｒ ｓｃ ｎ ｒ ｄ ｉ ｗｈ ｃ ｏ ａ ｙ ｐ ｓ ｉ ｅ ａ ｌ ａ ｏ ｗｉ ｅ ｕ ｎ ｉ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｏ
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猪伪狂犬病的诊断与鉴别方法猪伪狂犬病是由狂犬病毒V系病毒引起的一种新型狂犬病，也被称为马钩菌性狂犬病或伪狂犬病。

猪伪狂犬病在亚洲、欧洲、南美洲等猪养殖区已经成为一种普遍的疾病，对猪养殖业造成了严重的经济损失。

本文将系统地介绍猪伪狂犬病的诊断与鉴别方法。

病原学猪伪狂犬病是一种DNA病毒感染病，其病原体狂犬病毒V系病毒与狂犬病毒同属于家畜及人类中较为常见的病毒。

传染源主要是疑似或确诊养猪场中的猪，且其唾液、尿液、粪便、血液等各种体液均可携带病毒。

病原体可通过直接接触、飞沫传播、皮肤和黏膜等途径进入寄主体内，并在体内大量繁殖、扩散，引起机体免疫反应，影响猪的生长发育，甚至导致死亡。

临床表现猪伪狂犬病的临床症状多样，主要表现为猪的食欲下降、体重下降、行走困难、神经兴奋症状等。

此外，病猪也会表现出食欲旺盛、睡眠质量变差、牙齿外露、鼻唇积液、呼吸急促、害怕光照等症状。

在发病初期，猪伪狂犬病与其他家畜疾病症状十分相似，因此在早期诊断十分困难。

诊断方法猪伪狂犬病的诊断一般采用病理学检查、血清学检查、分子学检查等综合方法。

下面将分别介绍这些检查方法。

病理学检查通过对猪的死亡组织和脑组织进行病理学检查，可发现神经元减少、神经胶质细胞增生、神经元胞质空泡变性、细胞核固缩等特征性改变，有助于病理学诊断猪伪狂犬病。

血清学检查猪伪狂犬病的血清诊断主要是通过血清学检测法进行的。

病毒单克隆抗体可以与感染的病毒结合形成免疫复合物，通过酶标记法、荧光标记法、金标记法等将免疫复合物依次检测、染色和检视，从而确定猪是否感染猪伪狂犬病毒。

分子学检查猪伪狂犬病的分子学检测方法主要是通过PCR技术对病毒核酸进行扩增和分析，以确认病猪体内是否存在病毒。

PCR技术检测猪伪狂犬病的敏感性和特异性都比较高，因此其检测结果较为可靠。

鉴别方法鉴别猪伪狂犬病的方法主要是通过病型鉴别、病原学鉴别、血清学鉴别、分子学鉴别等多种方法进行筛选。

下面将分别介绍这些鉴别方法。

伪狂犬病的诊断
• 目前应用的疫苗大多是弱毒苗，国产抗体检测的方法是乳 胶凝集试验法，不能将自然感染与疫苗产生的抗体区分开 来，因此，不利于猪场的净化。 • 国外在控制和扑灭进程中，突破性的成果是应用了 gE, gI基因缺失的标志的疫苗,并结合 gE-ELISA对猪群进行检 疫，使伪狂犬病得到很好的控制与扑灭。 • PCR:对野毒感染的监测 • 对冰冻切片作直接荧光抗体(FA)试验，扁桃体是首选病料
肉品中伪狂犬病毒临床样本检测结果
乳胶颗粒（不同直径大小）
/Default.aspx?ta bid=65 /scg/binks/Desforge s%20project.htm
乳胶凝集试验
• 病毒或蛋白致敏乳胶颗粒，制备成诊断抗原 病毒或蛋白致敏乳胶颗粒， • 现场圈舍旁边检测抗体， 现场圈舍旁边检测抗体，
实验内容
• gE-ELISA检测野毒抗体 • gB-ELISA检测疫苗抗体 • 乳胶凝集试验检测全病毒抗体
酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 将病毒、纯化的蛋白质等抗原包被在酶联 将病毒、 板上，通过间接法、 板上，通过间接法、竞争法等程序检测抗 体。
抗原捕获酶联免疫吸附试验 －适用于大规模样本病毒抗原的检测
实验7 伪狂犬病的诊断
实验目的
• 熟悉并掌握伪狂犬的实验室诊断方法
猪伪狂犬病
由伪狂犬病病毒引起的一种急性传染病 体温升高，神经症状， 体温升高，神经症状，还可侵害消化系 隐性感染，引起流产、 隐性感染，引起流产、死胎及呼吸系症状 无奇痒
流行病学
病猪、 病猪、带毒猪以及带毒鼠类 精液 母猪感染本病后6-7d乳中有病毒，持续3-5d，乳猪可 乳中有病毒，持续 母猪感染本病后 乳中有病毒 ， 因吃奶而感染本病。 因吃奶而感染本病。 哺乳仔猪日龄越小，发病率和病死率越高 哺乳仔猪日龄越小，

伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立李雪明;于红欣;杨红杰;王俊;周双海【摘要】伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考.用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒.以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR Green I来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增.结果显示:在(6.9×107～6.9×101) copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系.该方法最低可准确检测69 copies/μL 的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2％,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法.研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR Green I荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测.【期刊名称】《北京农学院学报》【年(卷),期】2015(030)004【总页数】4页(P74-77)【关键词】伪狂犬病病毒;gE基因;荧光定量PCR;伪狂犬病病毒野毒【作者】李雪明;于红欣;杨红杰;王俊;周双海【作者单位】北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京市顺义区动物疫病预防控制中心,北京101300;北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京市顺义区动物疫病预防控制中心,北京101300;北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京农学院动物科学技术学院,北京102206【正文语种】中文【中图分类】S852.65伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)是双链DNA病毒，属于疱疹病毒科，能够感染多种家畜和野生动物；PRV对猪的危害最大，PRV感染可引起种猪繁殖障碍及哺乳仔猪大批死亡，年龄较大的猪则多系隐性感染，但可长期带毒排毒[1]。

飞沫感染狂犬病-伪狂犬病怎么检测伪狂犬病怎么检测伪狂犬病的流行病学特征这种疾病是一种急性传染病，可被多种家畜和野生动物感染。

猪在家畜中更常见，但狗也可能被感染。

当疾病在养猪场爆发时，狗经常在猪之前或同时出现。

其病原体是伪狂犬病病毒。

因为这种疾病与狂犬病有相似的症状，所以以前被认为是与狂犬病相同的疾病。

后匈牙利学者阿胡杰斯基证明，这种疾病与狂犬病不是同一种疾病，而是一种独立的疾病，所以也称为阿尔茨海默病。

因此，病猪是各种动物的传染源。

狗经常在吃了病猪肉或死鼠肉后被感染。

病狗虽然致死率高，但是不能解毒。

该病主要通过消化道感染，但也可通过呼吸道和皮肤伤口感染。

伪狂犬病病毒对外界环境有很强的抵抗力。

但是这种病毒对化学药物不是很有抵抗力，比如石灰乳、盐酸、氢氧化钠、等。

可以快速。

伪狂犬病诊断要点(1)流行特征猪和小鼠是该病最重要的传染源，其他动物的感染主要与接触这两类动物有关。

从感染猪的角度来看，狗的自然感染与饲养感染该病毒的啮齿动物有关，饲养感染该病的牛、羊肉也是二次感染途径。

此外，它还可以被飞沫和伤口感染。

这种病是散发的，有些是区域性的。

)和流行特征，可以做出初步诊断。

对于症状不典型的病例，单靠临床诊断是很难确诊的。

伪狂犬病的防控措施第一，禁止狗进入猪场。

第三，生病的狗要及时隔离。

有条件的话可以给狗注射抗伪狂犬病的高度免疫血清，有一定疗效。

患病犬的粪便应及时清洗消毒。

第四，根据犬猪接触情况和吃猪肉的情况进行接种。

2ml；5ml，3周后再一次，剂量为1ml。

犬瘟热感染的几种原因小鹿犬犬瘟热是犬类第一类传染性疾病，严重威胁狗狗生命健康的急性传染病。

?具体下面一一介绍。

一、飞沫传染这是一种比较常见的传染犬瘟热的途径。

当您带着您的狗狗在人员密集和众多的狗爸爸妈妈们一起聊天时，也许您的狗狗和众多的狗狗一起玩时被病犬感染了。

因为犬瘟热病毒可以通过喷嚏、飞沫等随着空气一同感染健康的狗狗。

二、间接传染。

这主要通过人类或者其他东西导致健康的狗狗感染犬瘟热。

母猪伪狂犬病 （ Ｐ Ｒ ） 是 由疱疹病毒引起母猪 的 种 传染 性 、 免疫 抑 制性 疾病 。可 引起怀 孕 母 猪流 产、 死产 、 返 情等 。现就其 抗体 检测试 验进 行 阐述 。
一
表 １ 母 猪 血 清 抗体 检 测 结 果
猪场 号 检 测 母猪 数
猪场 １ 猪场 ２ ３ ０ ３ ０
纸 吸干 。
（ ３ ） 每孔加酶标记物 １ ０ ０ Ｌ ， 置３ ７ ￣ Ｃ 温育 ３ ０ ｍ ｉ ｎ 。 （ ４ ）甩 掉 板 孔 中 的溶 液 ，再 用 洗 涤 液 洗 板 ５ 次， ２ ０ ０ Ｌ ／ 孔， 每 次静 置 ３ ｍｉ ｎ 倒掉 ， 最 后 一次 用 吸
水纸 吸 干 。
试 验 研 究
母猪伪狂犬病抗体检测及分析
王 艳春
（ 天 津 市 蓟 县 罗庄 子 镇 兽 医 站 ，天津 蓟 县 ３ ０ １ ９ ０ ２）
ＤＯ１ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ Ｊ ． Ｉ Ｓ ＳＮ． １ ６ ７ １ － ６ ０ ２ ７ ． ２ ０ １ ５． ０ ９． ０ １ ４
阳性 头 数 阴 性 头数
１ ６ １ ７ １ ４ １ ３
阳性 率 （ ％ ）
５ ３ ． ３ ５ ６ ． ７
１ 材料 与方 法
１ ． １ 材
料
天津地区 ４ 个猪场的母猪 ， 每个猪场
猪场 ３
猪场 ４ 合 计
３ ０
３ ０ １ ２ ０
１ ６
１ ５ ６ ４
稀 释 待检血 清， 阳性 对照 与 阴性 对照 １： １ 稀释。 １ ． ２ － ３ 试 验步 骤 （ １ ）取 预包 被 的 检测 板 ， 取 稀 释 好 的待检 血 清 １ ０ ０ Ｌ加 入 抗原 包 被板 中 ，同时设 阴 、 阳性 对 照 孔 （ １： １ 稀释） ，各 设 ２孔 ，每 孔 １ ０ ０ Ｌ 。轻轻 振匀 孔 中样 品 ， 置３ ７ ￣ Ｃ 温育 ３ ０ ａｉ ｒ ｎ 。 （ ２ ）甩掉 板 孔 中的溶 液 ，用 洗 涤液 洗 板 ５次 ， ２ ０ ０ Ｌ ／ 孔， 每次静置 ３ ｍ ｉ ｎ倒 掉 ， 最 后 一 次 用 吸 水

伪狂犬诊断标准伪狂犬病是一种由伪狂犬病毒引起的急性传染病，主要侵害动物的神经系统和呼吸道。

这种病毒可以感染多种动物，包括猪、狗、猫、牛、羊等。

伪狂犬病会导致动物的死亡和严重的经济损失。

因此，建立伪狂犬病的诊断标准对于预防和治疗这种疾病非常重要。

一、引言伪狂犬病是一种高度传染性的疾病，对于动物的健康和生命安全造成了极大的威胁。

为了准确诊断伪狂犬病，及时采取有效的防治措施，降低经济损失，制定本标准。

二、范围本标准适用于伪狂犬病的诊断和鉴别诊断，包括临床诊断、病理学诊断、实验室诊断等方法。

三、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

1.GB/T 18640-2018 动物疫病诊断与防治规范总则2.GB/T 27985-2011 动物病毒检测规范3.GB/T 36879-2018 动物疫病监测技术规范四、诊断标准1.临床诊断：伪狂犬病可导致动物的神经系统和呼吸道症状，包括不安、惊厥、流涎、呕吐、咳嗽等症状。

在临床诊断中，应注意与狂犬病等其他类似疾病的鉴别诊断。

2.病理学诊断：伪狂犬病毒感染会导致动物的组织病变，包括神经元变性、坏死和炎症反应等。

病理学诊断可通过观察组织病变的特征性表现进行确诊。

3.实验室诊断：实验室诊断是伪狂犬病确诊的主要方法之一。

可采用的方法包括聚合酶链式反应（PCR）、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、核酸杂交等分子生物学方法，以及病毒分离、血清学检测等传统方法。

其中，PCR等分子生物学方法具有高灵敏度和特异性，可用于检测伪狂犬病毒的特异性基因片段。

血清学检测可检测动物血清中的特异性抗体，用于评估免疫状态和流行病学调查。

4.鉴别诊断：伪狂犬病应与狂犬病、猪脑炎等其他神经系统疾病进行鉴别诊断。

这些疾病也具有类似的临床症状和病理学表现，但病原不同。

鉴别诊断可通过临床症状、病理学检查和实验室检测等方法进行综合判断。

十一、伪狂犬病检测方法伪狂犬病病毒分离鉴定1 材料准备DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul 微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。

溶液配制见附录A(标准的附录)2 操作步骤2.1病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4℃送实验室检测。

2.2样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1：5乳剂，—70℃反复冻融后，经3000rpm离心30分钟后，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL，—70℃保存作为接种材料。

2.3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，37℃恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（经过56℃水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，置37℃温箱中培养。

2.4观察结果接种后24—48小时，BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应（Cyto pathogenic effect, CPE），表现为细胞变圆，脱落。

如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。

2.5病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。

伪狂犬病聚合酶链式反应1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。

溶液配制见附录C(标准的附录) 引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434—651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。

序列为，上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’，下游引物P2：5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR扩增仪，电泳仪2操作步骤：2．1 样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。