Pichiapastoris表达系统的启动子研究进展

利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。

影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。

生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

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重组人血清白蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达摘要人血清白蛋白是一种在医学上应用广泛，需求量大的蛋白质药物。

而目前血浆提取生产的方式难以满足市场的要求，用基因工程方法生产人血清白蛋白无疑具有巨大的商业价值。

由于巴斯德毕赤酵母表达系统自身的许多优点，使得其在表达外源蛋白中具有十分大的优势。

本文的工作是用巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）构建并筛选分泌重组人血清白蛋白(rHSA)基因工程高产菌株，并对其发酵纯化条件进行初步研究。

在构建高产人血清白蛋白的基因工程菌时，采用了分泌型表达质粒pPIC9K构建成质粒pPIC9K-hsa。

构建的质粒经线性化后电转化整合进入毕赤酵母GS115染色体AOX1基因中，通过MD/MM平板筛选出his+Mut s型菌株。

在此基础上，用G418平板筛选出高拷贝表达子。

BMGY/BMMY摇瓶培养对不同的拷贝子进行筛选，发现随着拷贝子的增加表达量增加。

其中菌株GS115-rHSA-8表达量最高。

免疫印迹检测所表达的rHSA具有免疫原性。

采用工业基础盐培养基，用摇瓶对发酵条件进行了实验研究。

结果表明，组氨酸的加入量为0.15g/L时，蛋白表达量增加57.1%；加入0.10%体积比油酸时，蛋白量可增加43.4%；甲醇浓度控制在0.5％体积比左右时可以获得高产量，甲醇的加量超过1%体积比时，会对蛋白的分泌表达产生抑制，在2%时已经比较明显；甲醇诱导时添加甘油时可以提高产量，但当甘油添加量达到0.2%体积比时甘油已产生抑制表达作用；诱导表达时硫酸铵浓度为7g/L时蛋白浓度最高，高于9g/L时已开始出现抑制表达作用；改变培养时发酵液的pH为7.0，诱导表达时添加 1.5%的YP(Yeast extract,5g/L; Peptone, 10g/L)均可以有效的控制rHSA的降解，而温度对蛋白的降解没有显著性影响。

另外，添加100μm的PMSF也对降解有较好的控制作用，但因为毒性原因其安全性值得评价。

.2 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略1.2.1 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此，不论是胞内表达亦或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问题，这也是影响表达量的一个重要因素，同时，还增加了纯化目的蛋白的难度。

近年来，蛋白酶的研究是P.pastoris表达系统一个重点和热点。

越来越多的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究[52; 53]。

P.pastoris能根据细胞生长环境（碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫）来调整自身酶系，以合成与降解不同的蛋白和细胞器，液泡是蛋白质降解最主要的场所[54]，另一降解场所是细胞基质蛋白酶体中。

但是，对于外源蛋白来说，其降解常在表达和分离纯化的第一步，主要是由培养基中胞外蛋白酶，细胞外膜结合蛋白酶（cell-bound proteases）[55]和细胞自噬或裂解释放的胞内蛋白酶降解的[5]。

胞内蛋白酶主要涉及降解蛋白质前体产生活性蛋白；切除转运出膜后的蛋白质信号肽；使调控蛋白失活；降解变异或不需要的蛋白质；提供营养，前体和能量。

胞外蛋白酶分泌较少，主要降解部分蛋白质提供氨基酸和多肽等营养[22]。

根据蛋白酶的分泌和作用地点，P.pastoris的胞内蛋白酶可以分为三种类别，即液泡蛋白酶（vacuolar proteases），细胞基质蛋白酶体（the cytosolic proteosome）以及分泌途径的蛋白酶（proteases located along the secretory pathway）[52; 56]。

表1.2 毕赤酵母液泡蛋白酶和分泌途径蛋白酶[57]Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory pathway[57]Enzyme Type Gene Zymogen formVacuole PrA Aspartic PEP4 YesPrB Serine PRB1 YesCpY Serine PRC1 YesCpS Metallo-( Zn2+) CPS1 UnknownApI Metallo-( Zn2+) LAP4 YesApCo Metallo-(Co2+) DAP2 NoDPAP-B Serine SEC11 UnknownSecretory pathway signal peptidase Kex2protease Serine KEX2 YesKex1 carboxypeptidase Serine KEX1 NoDPAP-A Serine STE13 Unknown,predict noYeast aspartyl protease ш Aspartic YAP3 Unknown,predict yes酵母液泡位于基质中，一方面是维持胞内pH和盐离子平衡，储藏盐离子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特异性的水解酶，较宽底物范围的内生和异源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至细胞器的一个重要场所，大约80％的蛋白在液泡中降解[57]。

Pichia酵母表达系统使用心得摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。

生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。

其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。

+ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。

在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。

另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。

毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展作者：方园园来源：《绿色大世界》2009年第12期摘要:经过近20年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经成为目前最成功的真核表达系统之一,被广泛用于医药生产、饲料添加剂开发和科学研究。

介绍了毕赤酵母的生物学特性、常用菌株和表达载体的特点及其研究进展,并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势。

关键词:毕赤酵母;表达载体;外源蛋白中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1005-569X(2009)12-0037-031 引言巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),有较好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一般为28～30℃,是常用的外源蛋白表达系统。

2 巴斯德毕赤酵母宿主菌株根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型。

绝大多数毕赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOX1基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOX2虽然与AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培养基内该型毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,细胞不能进行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。

后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少,有时其表达量甚至高于Mut+型。

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证收稿日期：2009-03-11基金项目：黑龙江省生物菌种资源共享平台建设（KT05A400-1）作者简介：宋庆凤（1983-），女，黑龙江人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。

*通讯作者：李杰，副教授，硕士生导师，研究方向为植物分子遗传学与基因工程。

E-mail:lijie_neau@宋庆凤，暴立娟，李杰*（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）摘要：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。

用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多，却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。

研究设计以毕赤酵母组成型启动子-GAP 启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX ，成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPH α。

并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn 2为报告基因进行功能验证，结果表明，该载体可实现xyn 2基因在毕赤酵母中的高效表达。

在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU 替换载体上原有的α-Factor 信号肽，结果表明，INU 信号肽能够有效引导XYNII 的分泌。

关键词：毕赤酵母；表达载体；GAP 启动子；INU 信号肽中图分类号：文献标识码：A文章编号：1005－9369（2009）07－0055－05Construction and probation of neotype secreting expression vectors for Pichia pastoris /SONG Qingfeng,BAO Lijuan,LI Jie （College of Life Sciences,Northeast Agricul-tural Unive rsity,Harbin 150030,China )Abstract:Pichia pastor is is one of the foreign protein expression system which has been widelyused.The expression vectors for Pichia pastoris are varied,but they can not be used in food vocation,because of the need of methanol in expression and the leading-in of antibiotic gene by transformation.This research designed to replace the methanol induced AOX promoter by Pichia pastoris 's constitutional promoter,GAP promoter,and successfully constructed the secreting expression vector pGAPH αfor Pichiapastoris .The gene encoding endo-β-1,4-xylanase from Trichoderma Reesei,and xyn 2gene were used as a reporter gene,and then the function probation indicated that the xyn 2gene could be overexpressed inPichia pastoris .Based on this neotype secreting expression vector pGAPH αⅡ,we replaced the α-Factor by inulase gene's signal peptide sequence which had been optimized in codon,the results showed that the showed gene's signal peptide could also utility guide the secreting expression of xyn 2gene.Key words:Pichia pastoris ;expression vector;GAP promoter;INU signal peptide 随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。

毕氏酵母蛋白表达系统原理1.引言1.1 概述概述在生物科学研究中，表达外源蛋白是一个常见的实验手段，用以研究蛋白的结构和功能。

而毕氏酵母蛋白表达系统作为一种重要的表达系统之一，已经被广泛应用于各个领域，包括基因工程、药物研发和生物制药等。

本文将对毕氏酵母蛋白表达系统的基本原理和优势进行详细介绍。

毕氏酵母（Pichia pastoris）是一种单细胞真菌，具有高效的蛋白表达能力和较高的细胞密度。

毕氏酵母蛋白表达系统是基于毕氏酵母的遗传工程技术，通过将外源基因嵌入到毕氏酵母的基因组中，使其能够产生大量特定蛋白。

其主要原理是利用毕氏酵母的内源启动子和信号序列来调控外源基因的表达，并通过细胞代谢途径来实现对外源蛋白的正确折叠和修饰。

毕氏酵母蛋白表达系统相比其他表达系统具有许多优势。

首先，由于毕氏酵母的生长速度较快，表达时间相对较短，可以迅速得到目标蛋白。

其次，毕氏酵母能够产生大量的外源蛋白，产量可以达到克级甚至克拉级。

此外，毕氏酵母蛋白表达系统具有高选择性，外源基因在毕氏酵母中的稳定性较高，避免了外源基因的丢失或突变。

总之，毕氏酵母蛋白表达系统是一种广泛应用的表达系统，其基本原理和优势使其成为生物科学研究中重要的工具。

本文将进一步深入介绍毕氏酵母蛋白表达系统的基本原理和其在科学研究和应用中的潜力。

1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分旨在介绍本文的整体框架和各个章节的内容安排，以便读者更好地理解和阅读本文。

本文包含引言、正文和结论三个主要部分。

1. 引言部分（Introduction）是文章的开篇，旨在引起读者的兴趣并提供对毕氏酵母蛋白表达系统原理的总体概述。

其中，1.1概述部分将简要介绍毕氏酵母蛋白表达系统的基本概念和背景信息；1.2文中结构部分（Article Structure）将详细介绍本文的整体结构安排，以便读者明确每个章节的内容；1.3目的部分（Objective）将说明本文的研究目的和意义，为后续内容提供背景和动机。