CRISPR-Cas9体系实验流程 (2)

基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的工具，能够精确切割和修改DNA 序列。

它已被广泛应用于实验室研究、农业、医学和生物技术领域。

CRISPR-Cas9的操作步骤分为设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选、验证等几个阶段。

以下是基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤：1. 设计目标序列首先，确定要编辑的基因序列。

识别目标区域，通常选择高度保守的DNA 区域，以最大程度减少非特异性修饰。

目标序列的设计需要遵循一些规则，例如避免重复、剪切酶的PAM序列靠近目标区域等。

2. 构建修饰体根据设计的目标序列，构建CRISPR修饰体。

修饰体通常由CRISPR核酸（包括crRNA或sgRNA）和Cas9核酸组成。

crRNA（或sgRNA）负责定位到目标序列，Cas9则负责剪切目标序列。

合成修饰体的DNA或RNA序列后，可以使用PCR扩增或化学合成的方法得到修饰体。

3. 细胞转染将构建好的修饰体转染至目标细胞中。

转染可以选择不同的方法，例如化学法、电穿孔法、超声波法或病毒载体等。

转染后，修饰体会逐渐进入目标细胞，并开始作用于基因组。

4. 筛选在转染后，大部分细胞仍然具有未被编辑的基因组。

为了筛选出完成编辑的细胞，可以使用筛选方法。

最常用的方法是通过引入荧光蛋白标记的修饰体，利用流式细胞术或显微镜检查标记的细胞。

5. 验证对于筛选出来的细胞，需要进行进一步的验证。

最常用的方法是通过测序确认基因组是否发生了预期的编辑。

此外，也可以使用T7E1酶切或限制性内切酶消化等方法，进一步验证编辑效果的准确性。

总结起来，基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤包括设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选和验证等几个阶段。

通过遵循这些步骤，研究人员可以实现对目标基因组的精确编辑，进而揭示基因功能、治疗遗传疾病，并在农业和生物技术领域开拓新的应用前景。

一、CRISPR-Cas9 细胞基因敲除敲入实验基本操作流程1)设计sgRNA ：1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。

找到该基因CDS 区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。

按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。

对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子A TG后的外显子上。

如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。

1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input 框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。

一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer AdjacentMotif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。

而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。

因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。

不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。

因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。

根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos （同时设计检测目的基因的引物一起合成）。

1、/2、/mpg/crispr_design/3、/~slin/cas9.html4、/E-CRISP/5、/6、/crispr/,Drosophila7、/index.jsp8、/casot/index.php9、/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx10、/根据酶切方式，选择合适接头，例如，PX458等质粒sgRNA靶点oligo如下（Bbs1酶切）5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3‘- CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5‘（1）对于sgRNA的长度，一般应为20 nt左右；（2）对于sgRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的sgRNA，同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为40%~60%；（3）sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低（4）如果构建U6或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需考虑sgRNA的5' 碱基为G或GG，以提高其转录效率；（5）对于sgRNA靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的A TG下游，最好位于第一或第二外显子；（6）检查sgRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs；（7）如采用Cas9单切口酶，设计paired-gRNA需考虑成对sgRNA的间距；（8）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少5个碱基。

基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法与注意事项基因编辑技术是一种快速、高效修改生物体基因组的方法，近年来取得了显著的进展。

其中，CRISPR-Cas9技术被广泛应用于基因组编辑领域，成为一种常用的工具。

本文将介绍CRISPR-Cas9的使用方法和相关的注意事项。

CRISPR-Cas9基因编辑技术是通过RNA引导的Cas9蛋白复合物识别特定DNA序列，并将其切割，以实现对基因组的修改。

下面将详细介绍使用CRISPR-Cas9的步骤和注意事项。

1. 目标序列选择与设计在使用CRISPR-Cas9进行基因组编辑之前，首先需要选择并设计一个适合的目标序列。

目标序列应具有特异性，同时应具备足够的保守性，以确保CRISPR-Cas9的高效性和准确性。

此外，目标序列还应远离重要基因或调控区域，以避免非特异性的剪切事件。

2. CRISPR RNA合成CRISPR RNA（crRNA）是一种由CRISPR序列和目标序列组成的RNA分子。

它通过碱基配对与Cas9蛋白结合，从而指导Cas9蛋白与目标DNA序列配对，并发生切割。

在合成crRNA时，需要注意避免污染和二聚体的形成。

3. Cas9蛋白表达和纯化Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统的核心组成部分，它能够与crRNA形成复合物并介导DNA的切割。

在使用Cas9蛋白之前，需要将其进行表达和纯化。

选择合适的Cas9表达系统和纯化方法，确保获得高纯度的蛋白样品。

4. CRISPR-Cas9复合物形成将crRNA与Cas9蛋白复合形成CRISPR-Cas9复合物，是基因组编辑过程中的关键步骤。

将纯化的Cas9蛋白与合成的crRNA按照一定的比例混合，在适当的条件下进行复合，形成稳定的复合物。

注意事项包括避免RNase和DNA酶的污染，以及控制复合物的浓度和组装时间。

5. 细胞渗透与转染在进行基因组编辑之前，需要将CRISPR-Cas9复合物引入目标细胞内。

细胞渗透和转染是常用的方法，常用的技术包括细胞渗透剂、转染试剂、电穿孔等。

CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程Puro 抗性浓度摸索实验将细胞如下图1稀释。

给药7天后，弃培养液，用台盼蓝染色2 min，显微镜下观察细胞存活情况。

确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞筛选浓度。

图1 抗性浓度摸索单克隆形成验证实验细胞计数，将细胞悬液稀释混匀后加入96孔板，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养。

静置培养48 h后每日观察并记录单克隆形成情况。

sgRNA 靶标设计根据基因序列信息，设计 sgRNA。

靶标位点序列信息确认PCR扩增（图2），测序验证基因序列，以确定sgRNA区域有无SNP。

图2 靶标序列扩增sgRNA克隆引物合成根据sgRNA设计sgRNA克隆引物。

lentiCRISPRv2-sgRNA载体构建退火，连接，转化，涂板（LB/Amp）培养。

lentiCRISPRv2-sgRNA载体验证每个实验组各挑取6个单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果（图3）。

图3 质粒抽提酶切验证：取3个单克隆进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图4）。

选择2个样品送样测序。

图4 单克隆酶切验证病毒包装lentiCRISPRv2-sgRNA无内毒素质粒提取，病毒包装。

细胞转染配制梯度病毒稀释液，细胞于培养箱中静置培养48h。

阳性单克隆细胞株筛选细胞转染48h后，更换完全培养基，筛选至对照组大部分细胞死亡，实验组细胞扩大培养，进行单克隆筛选。

几天后挑选阳性单克隆进行扩增，并取样验证。

阳性单克隆细胞株验证测序验证阳性单克隆细胞株的基因序列，以确定是否敲除成功。

实验结果示例：该基因有两个单克隆细胞株，A1和A2。

单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式，分别缺失1个和19个碱基，在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。

单克隆细胞A2的目的基因在sgRNA2位置发生突变，插入1个碱基，在新序列的第340位碱基提前出现终止密码子。

CRISPR-Cas9体系实验流程(2)一、材料试剂准备1）质粒：pSpCa9(BB)(AddgeneplamidID:42230)，若实验用gRNA为PCR扩增纯化产物，则需要该质粒做为U6的模版。

pUC19(Invitrogen,cat.no.15364-011)可用于构建gRNA，若用PCR 产物进行转染，则需要该质粒来进行共转染，做为DNAcarrier。

上述三种质粒，根据实验选择gRNA的表达方式（PCR产物/单载体系统/双载体系统）来确定具体使用哪种。

2）超纯水，DNae/RNae-free(LifeTechnologie,cat.no.10977-023) 3）高保真聚合酶，KapaHiFi(KapaBioytem),PfuUltra(Agilen)，HerculaeIIfuionpolymerae均可，只需保真效果好，扩增过程不产生突变。

4）TaqDNApolymeraewithtandardTaqbuffer(NEB,cat.no.M0273S)用于一般检测。

5）QIAquickgele某tractionkit(Qiagen,cat.no.28704)6）QIApreppinminiprepkit(Qiagen,cat.no.27106)7）FatDigetBbI(BpiI)(Fermenta/ThermoScientific,cat.no.FD1014)，如需要将gRNA构建到pSpCa9(BB)-2A-GFP质粒上，则需要该酶。

8）T7DNAligaewith2某rapidligationbuffer(Enzymatic,cat.no.L602L).或者T4DNAligae，二者无区别。

12）T4polynucleotidekinae(NewEnglandBioLab,cat.no.M0201S)13）PlamidSafeATP-dependentDNae(Epicentre,cat.no.E3101K)14）Adenoine5′-triphophate,10mM(NewEnglandBioLab,cat.no.P0756S)15）SOCmedium(NewEnglandBioLab,cat.no.B9020S)二、实验流程或者人工手动选择，在目的区域5′-NGG（即PAM）上游20bp片段均可做为targetite，一般targetite可选在正义链或者反义链，二者均可。

《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9系统已成为现代生物医学研究中常用的基因编辑工具之一。

它为科研人员提供了强大的基因敲除、插入或突变的能力，在多种模型动物制备及疾病研究领域具有广泛的应用前景。

本文旨在介绍利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程，为相关研究提供技术参考。

二、材料与方法1. 材料(1) CRISPR-Cas9系统相关组件（包括Cas9蛋白、sgRNA 等）；(2) 小鼠胚胎干细胞系；(3) DUSP9基因特异性敲除载体；(4) 培养基、试剂及其他实验耗材。

2. 方法(1) 设计并构建DUSP9基因敲除载体；(2) 准备小鼠胚胎干细胞系并进行细胞培养；(3) 将DUSP9基因敲除载体与胚胎干细胞共培养，实现基因编辑；(4) 筛选并扩增成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞；(5) 对敲除细胞进行鉴定及保存。

三、实验过程1. DUSP9基因敲除载体的构建根据DUSP9基因序列，设计并合成sgRNA序列，构建DUSP9基因敲除载体。

通过PCR扩增获得目的片段，将其克隆至载体中，构建成功后的载体通过测序验证其准确性。

2. 小鼠胚胎干细胞的培养与准备将小鼠胚胎干细胞置于适宜的培养条件下进行培养，待细胞生长至适宜状态时进行后续实验。

3. 基因编辑及筛选将DUSP9基因敲除载体与小鼠胚胎干细胞共培养，通过CRISPR-Cas9系统实现DUSP9基因的敲除。

随后，通过PCR、测序等方法筛选出成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞。

4. 鉴定与保存对筛选出的成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞进行鉴定，包括细胞形态观察、生长曲线绘制、基因型鉴定等。

将鉴定合格的细胞进行保存，以备后续实验使用。

四、结果与讨论1. 结果通过CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，并筛选出成功敲除DUSP9基因的细胞。

基因编辑工具CRISPRCas9的使用方法详解自从科学家于2012年首次使用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑后，这项基因编辑工具引起了广泛的兴趣和研究。

CRISPR-Cas9是一种革命性的基因编辑技术，能够精确地修改细胞或有机体的基因组，为科学家们提供了探索基因功能、治疗遗传性疾病和改良农作物等无限可能。

CRISPR-Cas9的使用方法很简单，主要包括以下几个步骤：1. 设计引导RNA序列（sgRNA）：sgRNA是CRISPR-Cas9系统中的关键组成部分，它能够指引Cas9酶精确地将DNA剪切。

在设计sgRNA时，科学家需要选择一个目标基因的特定区域作为靶点，这个区域应该是单链DNA，并且具有20个连续核苷酸的序列。

2. 合成和验证sgRNA：一旦sgRNA序列设计完成，科学家们可以将其合成，并通过一系列实验来验证其有效性。

验证包括确认sgRNA与目标DNA序列的亲和力以及评估其能否成功引导Cas9酶到达目标基因。

3. 转染sgRNA和Cas9：一旦sgRNA和Cas9酶验证通过，科学家们将两者一起转染到要编辑的细胞或有机体中。

这可以通过各种转染方法实现，例如永生细胞中的电穿孔或胚胎中的胚胎注射。

4. 检测基因编辑：经过转染后，细胞或有机体中的Cas9酶和sgRNA会结合并识别并剪切目标基因的DNA序列。

科学家们可以通过PCR、Western blot、DNA测序等多种方法来检测基因编辑的效果。

一种常用的方法是T7终止测序，通过将目标基因进行PCR扩增，然后使用T7终止测序反应来确定基因编辑的结果。

总的来说，CRISPR-Cas9是一种快速、高效且精确的基因编辑工具。

然而，也需要注意一些潜在的问题和挑战。

例如，CRISPR-Cas9可能会造成非特异性的编辑效应，即不仅编辑目标基因，还会编辑其他非目标基因。

此外，CRISPR-Cas9的编辑效果可能会因细胞类型、转染效率以及sgRNA的选择等因素而有所不同。

CRISPR/Cas9基因编辑技术具体步骤及方法CRISPR/Cas9 是一种能够对基因组的特定位点进行精确编辑的技术。

其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA（guide RNA, gRNA）识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割，细胞随之利用非同源末端连接(Non homologous End Joining，NHEJ）或者同源重组（Homologous Recombination, HR）方式对切割位点进行修复，实现DNA水平基因敲除或精确编辑。

CRISPR基因敲除利用CRISPR / Cas9 进行单基因敲除目前研究最透彻、应用最广泛的II 型-CRISPR/Cas9 系统由两部分组成：1. 单链的guide RNA（single-guide RNA，sgRNA）2. 有核酸内切酶活性的Cas9 蛋白CRISPR/Cas9 系统利用sgRNA 来识别靶基因DNA，并引导Cas9 核酸内切酶剪切DNA（图1）。

当基因组发生双链DNA 断裂后，细胞通过非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 将断裂接合，在此过程中，将随机引入N 个碱基的缺失或增加，若N 非3 的倍数，则目的基因发生移码突变，实表1 CRISPR/Cas9 基因敲除与RNAi 比较CRISPR过表达利用CRISPR / Cas9 进行单基因过表达通过修饰CRISPR/Cas9 系统中的一些元件，形成一种蛋白复合物-协同激活介质（SAM），可实现对多数细胞内源基因的特异性激活。

该系统灵活方便，为研究基因功能提供了极为便利的工具。

CRISPR-SAM 系统由三部分组成：1. 失去核酸酶活性的dCas9（deactivated Cas9）-VP64 融合蛋白2. 含2 个MS2 RNA adapter 的sgRNA3. MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白CRISPR-SAM 系统中的MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白就是SAM，全称为SynergisticActivation Mediator( 协同激活调节器)，这也就是CRISPR-SAM 的命名由来。

CRISPR/Cas9敲除细胞系构建步骤及方法一、技术简介CRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术，也是目前研究最热的基因编辑技术。

由于其具有构建方法简单快捷、基因修饰效率高、成本低廉、实验周期短、适用范围广等诸多优点，目前已成功应用于人类细胞、斑马鱼、大/小鼠等多种动植物的基因组精确修饰。

二、实验流程1. 预实验1.1 Cas9导入细胞方法：尝试各种方法，如脂质体类转染、电转、慢病毒感染、腺病毒感染等，确定高效导入Cas9方法。

1.2 药物浓度预实验：降低后续阳性克隆筛选和检测工作难度。

1.3 单克隆培养情况：确认细胞是否可以单克隆培养。

2. 基因敲除（敲入）2.1 靶点设计：一般在不同转录产物的共同外显子上设计3个靶点，靶点位置尽量在基因CDS的前1/3，ATG之后，最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。

第一批合成构建3个，效果不佳或时间紧张的可一次构建6个。

2.2 载体构建和病毒包装：根据预实验结果，选择合适的普通载体或病毒载体（普通Cas9载体、慢病毒Cas9载体和腺病毒Cas9载体）。

2.3 内源活性筛选：转染细胞或感染细胞48h后，使用Puro或Blasticidin筛选48h，提取基因组DNA。

使用T7E1酶验证打靶载体的活性，将有效的突变型PCR产物测序验证。

2.4 Donor载体（基因敲入）：根据筛选的gRNA靶点位置，构建Donor普通载体或腺病毒载体，共转染/感染Cas9-gRNA和Donor。

2.5 单克隆筛选：无限稀释到每孔1个细胞的数量，每株细胞铺至少2个96孔板。

细胞数量足够后，验证内源活性并送测。

2.6 获得突变型：如需纯合子，则可能需要重复步骤3-5。

CRISPRCas9基因合成操作步骤及详细说明本文档将详细介绍CRISPRCas9基因合成的步骤与操作说明。

步骤一：设计引物在进行CRISPRCas9基因合成之前，首先需要设计合适的引物。

引物应包括靶标基因的DNA序列和与Cas9蛋白相结合的序列。

引物的设计可以借助各种基因编辑工具，如基因编辑软件和在线工具。

步骤二：引物合成和靶向序列放大根据设计的引物序列，可以选择商业实验室或合成生物学公司进行引物合成。

合成的引物可以通过PCR方法进行靶向序列的放大。

此步骤可通过以下步骤进行：1. 准备PCR反应体系，包括引物、PCR缓冲液、DNA模板和dNTPs。

2. 将PCR反应体系置于PCR仪中，进行适当的温度循环来放大靶向序列。

步骤三：提取和纯化靶向序列放大的靶向序列需要进行提取和纯化，以去除其他非目标DNA片段和杂质。

可以使用商业化的基因提取和纯化试剂盒来完成此步骤。

按照试剂盒的操作说明，将靶向序列提取和纯化至高浓度。

步骤四：CRISPRCas9系统装配在进行CRISPRCas9系统装配之前，准备如下材料：Cas9蛋白、sgRNA、纯化的靶向序列和核酸缓冲液。

1. 将Cas9蛋白与sgRNA按照一定的比例混合，使其形成复合物。

2. 加入纯化的靶向序列至Cas9-sgRNA复合物中，使其与靶向序列结合。

3. 将装配好的CRISPRCas9系统进行短暂的孵育，以便复合物形成稳定的结构。

步骤五：CRISPRCas9基因合成实验进行CRISPRCas9基因合成实验时，需准备以下实验材料：装配好的CRISPRCas9系统、细胞培养基、目标细胞。

1. 将目标细胞培养至合适的密度。

2. 通过转染或电穿孔等方法，将装配好的CRISPRCas9系统转导至目标细胞。

3. 维持目标细胞在适当的培养条件下，观察基因合成效果。

步骤六：结果分析与验证验证CRISPRCas9基因合成的有效性和准确性，可采取以下方法之一：1. DNA测序：通过对目标基因进行测序，确认其是否发生了改变。

基因编辑技术的CRISPRCas9系统的使用方法与注意事项基因编辑技术是一项革命性的技术，可以精确地修改生物体的基因组，对于研究基因功能、开发新药和治疗遗传病等方面具有重大意义。

其中，CRISPR-Cas9系统是最常用的基因编辑工具，它具有操作简单、效率高和成本低廉的优势。

本文将介绍CRISPR-Cas9系统的使用方法和注意事项。

使用方法：1. 设计gRNA序列：gRNA（guide RNA）是CRISPR-Cas9系统中用于识别和定位特定基因序列的RNA分子。

根据需要编辑的基因序列，设计合适的gRNA序列。

良好的gRNA设计可以提高编辑效率和特异性。

2. 合成gRNA和Cas9蛋白：合成和纯化gRNA序列和Cas9蛋白，或购买商业化的CRISPR-Cas9试剂盒。

确保获得高质量的gRNA和稳定活性的Cas9蛋白。

3. 细胞培养和转染：根据实验需要，选择合适的细胞系进行培养。

将合成的gRNA和Cas9蛋白导入到目标细胞中，常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒载体介导的转染法。

4. 检测CRISPR-Cas9介导的基因编辑效果：在转染后的细胞中，通过DNA测序、聚合酶链反应（PCR）或荧光显微镜观察目标基因的编辑效果。

选择适当的检测方法进行检测。

注意事项：1. 设计合适的gRNA序列：良好的gRNA设计对于系统的特异性和编辑效率至关重要。

避免设计具有高度相似序列的gRNA，以减少非特异性切割的风险。

使用在线工具或软件来优化gRNA序列的设计，同时考虑基因组的特异性和可能的非特异性靶向。

2. 选择合适的细胞系：不同的细胞系对基因编辑的敏感性和编辑效率有所差异。

在进行实验之前，了解目标细胞系的特点，并选择合适的细胞系进行实验。

确保细胞系的完整性和纯度，以提高编辑效果的可靠性。

3. 优化转染条件：有效的转染是保证CRISPR-Cas9系统成功应用的重要步骤。

优化转染条件，以确保gRNA和Cas9蛋白在细胞内能够有效导入并发挥作用。

基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法及注意事项概述基因编辑技术是一种革命性的科学工具，可以精确修改细胞和生物体的基因组。

其中CRISPR-Cas9成为最受关注的基因编辑技术之一，因其简便、高效和准确性而备受赞誉。

本文将介绍CRISPR-Cas9的使用方法及注意事项。

一、CRISPR-Cas9的基本原理CRISPR是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 的缩写，表示在易位区间（intergenic spacers）中间存在有一系列的短回文序列。

Cas9是一个典型的CRISPR相关蛋白，具有剪切双链DNA 的能力。

CRISPR-Cas9系统是通过引导RNA（sgRNA）与Cas9蛋白相结合，形成核酸酶复合物，使其能够精确地识别和通过碱基互补与目标基因的DNA序列结合并剪切。

二、CRISPR-Cas9的使用方法1．设计和合成引导RNA（sgRNA）sgRNA是CRISPR-Cas9系统中的关键部分，必须能够精确地与目标基因DNA序列配对。

在设计sgRNA时，需要注意以下几个方面：- sgRNA应该针对目标基因的特定区域，选择一个具有高度保守性的序列。

- 避免选择嵌合的互补序列，以免引起非特异性的DNA剪切。

- 确保sgRNA的序列无法与其他基因组中的DNA序列配对，以避免非特异性的DNA剪切。

2．合成Cas9蛋白Cas9蛋白可以由获得专利的CRISPR-Cas9公司购买，或者通过实验室内的表达系统获得。

合成或表达的Cas9蛋白可以通过亲和纯化方法来纯化。

3．转染CRISPR-Cas9系统将sgRNA和Cas9蛋白导入目标细胞的过程称为转染。

转染可以通过多种方法实现，包括化学物质转染、电穿孔转染、病毒载体转染等。

选择转染方法时，应根据特定的细胞类型和实验需求进行选择，并确保转染效率和毒性满足要求。

4．基因编辑的检测和分析在CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑后，需要对编辑结果进行检测和分析。

Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程Protocol No. PT140726-1Protocol No. PT140726-11，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：pGK1.1U6 CACC G CAAA 4 55’ -5’3’-3’ -- ～20bp2，操作步骤实验前，请您务必做好以下验证实验：A．单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可以形成单克隆。

B．目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分析靶基因的活跃度。

1. 设计Oligo DNA序列首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计：●麻省理工学院的CRISPR Design：/●德国癌症研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr下面我们选择麻省理工学院的CRISPR Design工具来做设计举例，以Fut8基因为例，一次只能输入大小为23～250bp的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。

点击“Download as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”Array根据左边的score的高低选取合适的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下（红色字体部分是要与Bbs I酶切后的载体相互补的部分）：Fut8-F: cacc G AATGAGCATAATCCAACGCCFut8-R: aaac GGCGTTGGATTATGCTCATTC※注意：oligo DNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。

另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp 的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。

基因编辑技术CRISPRCas9的操作步骤与技巧概述基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的基因工程方法，它使得科学家们能够准确、高效地修改生物体的基因组。

CRISPR-Cas9系统利用CRISPR序列指导Cas9酶进行DNA切割，并借助细胞自然的修复机制来实现精确的基因修饰。

本文将介绍CRISPR-Cas9技术的操作步骤，以及实验中需要注意的技巧和注意事项。

操作步骤：1. 设计合适的gRNA（引导RNA）序列：gRNA是用来指导Cas9酶精确切割特定DNA序列的RNA分子。

设计一个合适的gRNA序列是CRISPR-Cas9技术操作的第一步。

确保目标DNA序列位点的选择和gRNA序列的设计遵循一定的规则和原则，以提高操作的效率和准确性。

2. 合成gRNA和Cas9蛋白：合成合适的gRNA是CRISPR-Cas9技术的关键。

根据设计的gRNA序列，合成相应的gRNA。

同时，合成Cas9蛋白或利用表达载体将Cas9蛋白表达进入细胞中。

3. 转染gRNA和Cas9蛋白：将合成的gRNA和Cas9蛋白转染到目标细胞中。

可以使用合适的转染试剂和方法，如化学转染、电转染或病毒转染等。

确保gRNA 和Cas9蛋白能够成功地进入细胞内。

4. DNA切割和修复：一旦Cas9与gRNA形成复合物进入细胞核，Cas9便能够准确地识别和切割目标DNA序列。

DNA的切割会引发细胞内自然的修复机制，可以选择使用非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）来修复切割的DNA。

NHEJ修复机制常常带来插入缺失或错配，而HDR可以实现特定的DNA改造。

5. 筛选和检测：在进行CRISPR-Cas9基因编辑后，需要对细胞或生物体进行筛选和检测，以鉴定编辑效果和确认目标基因的改变。

可以利用PCR、Westernblot、DNA测序等方法验证基因的编辑和修饰效果，并在细胞或生物体水平进行相关功能性分析。

技巧和注意事项：1. 合适的gRNA选择：选择合适的gRNA序列对于CRISPR-Cas9技术的成功应用至关重要。

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crisprcas9基因编辑技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!CRISPR-Cas9 基因编辑技术流程一、准备工作阶段。

CrisprCas9腺病毒构建流程
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。

目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。

Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。

Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。

CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。

通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。

融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。

通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。

Crispr/Cas9腺病毒特点：
1、可感染多种分裂期和非分裂期细胞，感染效率高、敲除效率高；
2、操作简单，容易掌握；
3、基因敲除周期短，成本低；
4、适合哺乳动物不同种属不同基因的操作，适用范围广。

Crispr/Cas9腺病毒流程。