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实时荧光pcr原理实时荧光PCR原理。
实时荧光PCR（Real-time PCR）是一种能够在PCR过程中实时监测DNA扩增情况的技术。
它通过引入荧光探针或染料，实时检测PCR反应体系中的DNA量的变化，从而实现对PCR过程的实时监测和定量分析。
实时荧光PCR的原理主要包括以下几个方面：1. 荧光探针。
在实时荧光PCR中，常用的荧光探针包括TaqMan探针、Molecular Beacon探针和SYBR Green染料。
这些荧光探针在PCR过程中与靶标DNA结合，并产生荧光信号。
通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进程。
2. 荧光信号检测。
实时荧光PCR系统配备了特殊的光学检测装置，能够实时监测PCR反应体系中荧光信号的强度变化。
当靶标DNA逐渐扩增，荧光信号也会随之增加。
通过检测荧光信号的变化，可以实时获取PCR反应的动态信息。
3. 数据分析。
实时荧光PCR系统通常配备了专门的数据分析软件，能够实时处理和分析检测到的荧光信号。
通过对荧光信号的定量分析，可以计算出PCR反应体系中靶标DNA的初始量，并绘制出PCR扩增曲线。
通过PCR扩增曲线的形态和特征，可以对靶标DNA进行定量分析和检测。
4. 应用领域。
实时荧光PCR技术在生命科学领域有着广泛的应用，包括基因表达分析、病原微生物检测、基因型分析等方面。
由于其高灵敏度、高特异性和高准确性，实时荧光PCR已成为现代分子生物学研究和临床诊断中不可或缺的技术手段。
总结。
实时荧光PCR技术通过引入荧光探针和光学检测装置，实现了对PCR反应的实时监测和定量分析。
它在生命科学领域有着广泛的应用前景，为基因分析、疾病诊断和药物研发等领域提供了强大的技术支持。
随着技术的不断进步和完善，实时荧光PCR技术必将在未来发挥更加重要的作用。
荧光定量pcr步骤荧光定量PCR(real-timePCR)一种高通量的核酸定量分析技术，用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量。
荧光定量PCR是基于反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时PCR技术，结合这两种技术，可以非常快速地检测和定量基因表达。
本文将介绍荧光定量PCR的步骤。
第一步：样品的准备与检测1.1品的准备：首先，细菌或病毒样品根据实验要求进行灭菌或病毒灭活。
1.2测：根据需要，采用适当的抗体检测样品中是否有病毒和细菌，将病毒和细菌样品中的RNA或DNA分离出来，将分离出来的核酸用于下一步检测。
第二步：荧光定量PCR反应2.1品添加：将分离出来的核酸和所需的实验试剂（如反转录酶、DNA聚合酶、定量PCR探针、模板DNA，以及相关配套试剂）混合，反应体系得到。
2.2动PCR反应：将反应体系定温热处理，使反转录酶向模板DNA 中的特定序列引物亲和，以实现反转录。
2.3入PCR探针：将定量PCR探针加入反应液中，以实现基因表达荧光定量PCR。
2.4复PCR循环：每次循环引入一定量的反应物，以实现基因表达荧光定量PCR，并在每次循环时观察荧光信号，从而实现基因表达定量。
第三步：数据分析3.1据分析：对荧光信号数据进行定量分析，实现基因表达定量，并将结果画在实验曲线上，以观察基因表达的变化情况。
3.2验结果：在实验曲线上，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为基因表达量，可以观察实验结果，以确定基因表达量的情况。
荧光定量PCR步骤是用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量的有效技术，它包括样品的准备和检测、荧光定量PCR反应、数据分析三个步骤，可以快速准确地定量检测基因表达情况，为实验中的细菌和病毒基因分析领域提供有效的参考依据。
实时荧光定量PCR的数据分析方法
作者：易健明， 屈武斌， 张成岗， YI Jian-Ming， QU Wu-Bin， ZHANG Cheng-Gang
作者单位：易健明,张成岗,YI Jian-Ming,ZHANG Cheng-Gang(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知与心理卫生研究中心,北京100850;安徽医科大学研究生院,安徽合肥230032)
， 屈武斌,QU Wu-Bin(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知
与心理卫生研究中心,北京100850)
刊名：
生物技术通讯
英文刊名：Letters in Biotechnology
年，卷(期)：2015,26(1)
引用本文格式：易健明.屈武斌.张成岗.YI Jian-Ming.QU Wu-Bin.ZHANG Cheng-Gang实时荧光定量PCR的数据分析方法[期刊论文]-生物技术通讯 2015(1)。
实时荧光定量（Realtime ）PCR检测●原理所谓的实时荧光定量 PCR ，其反应体系中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线一般而言，荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。
PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT 值（ threshold value )。
定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。
荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。
对某一样品的C（ t ）值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。
CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表 CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数。
因些只要获得未知样品的 CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
SYBR Green Ⅰ荧光染料●荧光定量 PCR 实验过程a. 准备样品及试剂PCR Master Mix ；光学96孔板和光学盖；客户样品cDNA （浓度不低于10ng/ul ）；b. 设计并合成引物和 TaqMan 探针c. 定量 PCR 实验d. 引物和探针稀释e. 制备标准曲线样品取一个客户的样品做至少5个梯度稀释，用于做标准曲线。
一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。
由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。
通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。
当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。
在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。
最好能在冰上操作。
一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。
由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。
通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。
当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。
在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。
5. 每个样品至少3个平行孔。
参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。
real-time PCR 数据分析无论所使用的real-time PCR是何种型号，正确的数据分析对于获得有效的实验结果都是至关重要的。
这里介绍有关real-time PCR数据分析的知识。
在讨论基本分析过程之前，先介绍如何设计一个好的实验。
如果你是自己设计的引物和探针，那有助于下一步的工作。
但是在有些情况下，人们使用出版文献上的序列会更方便。
记住，即便是出版物提供的序列也不能保证会得到优化的实验结果。
而且排版错误的可能性也需要考虑在内。
所以进入实验室之前使用BLAST对全部序列进行核实确保他们是正确的。
下订单前先检察引物和探针的序列和Tm值是实验设计的基本要求。
标准曲线是判断实验质量的重要手段。
使用一个已知的模板，PCR产物，合成的寡核苷酸或转录的RNA做个标准曲线能够确定PCR的效率，敏感性，动态范围和其他的参数。
建立标准曲线时使用OD260的模板样本。
模板的总量以DNA分子的数量来描述，把质量转化为DNA含量的公式如下：（质量（克）*阿伏伽德罗常数）每个碱基的平均质量*模板的长度。
例如，合成70-mer的单链DNA，样本质量为0.8*10ˆ-11gm。
代入公式得：（0.8*10ˆ-11*6.023*10ˆ23molecules/mole）330gm/mole/base*70 base。
如果使用双链的模板，则碱基的平均质量为660gm/mole/base。
标准曲线使用的模板含量从1*10ˆ7开始连续稀释7次每次稀释10倍，最终得到10个模板拷贝。
这样的浓度有助于得到最高的ΔRn和最低的Ct。
用Excel画曲线时以模板数量的对数值为X，Ct（cycle threshold）值为Y轴。
标准曲线的计算公式如下：y=mx+b。
y就是Ct，m是斜率，x=log10template amount，b=y-intercept。
用斜率计算出实验效率Efficiency【10ˆ（-1/斜率）】-1。
实验效率告诉我们PCR反应的执行情况。
鉴定系数rˆ2是实际结果和理论值相符程度，表示稀释和移液的准确性。
y-intercept说明实验的敏感度和模板含量的精确度。
通过已知的模板含量，可以计算合成一定的DNA含量需要多少次循环：n=Log（Nn）-Log（N0）/Log（1+E）Nn是n次循环后的模板含量，N0是原来的模板含量，E是实验效率Efficiency，n是所需的循环数。
一个完美实验的斜率是-3.32，效率Efficiency是100%，y-intercept在33到37次循环之间，r^2是1.00。
如果效率（Efficiency）较低，y-intercept较高，这意味着循环开始时DNA的含量不足或需要多跑几个循环。
可以接受效率Efficiency在95-100%之间的实验结果，但如果y-intercept大大高于37或低于33，这说明没有准确的查明样本数量。
通常偏高的y-intercept 值是以低浓度存储，反复冷冻解冻造成样本变性的结果。
以标准曲线证实实验有效后，就能把同样的规范用于cDNA或RNA来优化样本准备。
设备运行后的数据分析建议按照以下的步骤进行。
1. Amplification curves。
如果没有这个曲线或看上去不正常，一定要查明原因解决问题。
首先应检查染色层（dye layer）和指定的reporter，看似简单的方法确是最有可能的解释。
如果曲线看上去很不规则，可能是样本中没有荧光剂，或者是加样口根本没有样本。
具体是那种情况大约在40次循环后就可以判明，解决方法是调节设备放弃那些无用的加样口，使曲线得以连贯。
2. Baseline所有的real-time PCR都用基线（Baseline）在早先的几次循环时来检测背景噪音和荧光剂里的试剂。
这样不完整的弧线出现在正式的读出数据之前，大约在第1个到第10个循环之间。
如果Ct的最低值小于基线的上限，应该调整基线值。
通常设置2-3个循环基线的上限低于Ct最低值。
判断基线设置是否合适可以观察增扩曲线（amplification curve）Y轴(ΔRn)的线性表达而不是对数方式，有时对数曲线上看似较好的趋势在线性图上则能反映出问题。
如果上限过高，会出现在基线之下很低的Ct。
调节基线直到曲线的直线部分与基线相仿。
正确的调节会使得彩虹状残缺的对数曲线消失。
同样地，极限的上限可能会过低，也可以观察线性增扩曲线来了解。
调节基线的影响主要在于低Ct的样本或高含量的模板，如果必须重复试验，稀释模板2倍就相当于把Ct系数改变1。
下一步的重点在设置正确的阈值。
当所有增扩标定点处于指数级增长阶段，用对数值显示Y轴。
不太可能设置阈值能适合所有的曲线，一个实验里采用多种阈值只适用于mRNA含量低造成ΔRn 非常低的情况。
有人认为阈值尽可能比较好，有些分析软件调整阈值造成标准曲线有很高的R^2。
还有人认为最精确的Ct来源于选择SDM最大的曲率。
其实并没有最佳的阈值，设置低造成低Ct 也许有益于某些情况。
样本含量上2倍的差异带来Ct值1倍的变化，对效率（efficiency）的影响接近100%。
3. 污染控制（No template controls，NTC）确保测试的是样本为不是污染物，建议在正式样本前的加样孔中加入2-3个无模板对照样本。
加入正式样本前先封闭对照组，同样准备2-3对照样本在加样完成后加入。
这个步骤能发现样本是否被污染及其程度。
NTC显示Ct值低于40，可以检查增扩曲线来了解详情。
如果曲线平稳的增加不存在指数级的提高，或增扩速度很慢，用线性图观察ΔRn图形。
一种情况是下降的ROX同时FAM不变。
另一种是FAM上升但ROX不变。
使用多重试图检查每个加样孔的所有荧光试剂，搞清楚报告的信号和有关染料的关系。
如果是轻度污染，可以调节阈值来消除影响或移除有关的加样孔。
如果NTC出现指数级增扩，会是先前实验留下的PCR产物造成的。
处理方法：用dUTP (2’deoxyurindine 5’triph osphate)和酶UNG(uracil-N-glycosylase)替换dTTP。
4. 无逆转录控制（No reverse transcription control）如果real-time PCR用于mRNA定量分析，需要评估样本中染色体污染物的总量。
加入一个不含逆转录酶的样本（-RT）。
如果-RT的结果是阳性的，可以用DNase处理样本去掉主要的污染物但会减低RNA的产量，或设计引物/探针跨基因间区，或一直使用逆转录控制。
阳性控制阳性控制最好的方法是标准曲线。
用它来做量化分析，斜率和y-intercept反映了实验质量。
如果不能使用一条人工标准曲线，一条覆盖小段DNA或全长RNA的标准曲线能反映出实验的效率。
如果实验没有增扩效果，把注意力放在试剂和模板可能存在的问题上。
5. 实验样本不同厂商的探针会有不同的表现和不同的最大ΔRn值，这个差别能从实质上影响ΔRn。
但它们不会妨碍指数级增扩，只要增扩期间在设置好阈值相关数据就可用于分析工作。
有可能出现当ROX平稳下降，一些曲线在指数级增扩前是平行的状况。
还有可能看似存在增扩的曲线其实是假的。
分析软件会尽其所能处理数据，然而如果ΔRn大大的低于1，应该直接怀疑没有真正的增扩存在无论曲线看上去如何。
6. CV（coefficient of variance）CV（coefficient of variance）是标准偏差除以算数平均，用来测量实验内的再现性和实验的变化。
如果CV值较小对实验没有影响。
如果一个加样口的值明显不同于其他的，重复后的实验任然出现这样的结果，使用多成分窗口（multicomponent view）或光谱窗口（raw spectra）检查增扩情况。
如确实没增扩就需检查是否加入了探针荧光剂，也要可能缺少了探针。
排除了探针的可能性后再检查是否加入了模板。
如果异常加样口的Ct较低，可能模板被加了2次。
重复加入模板只会降低Ct 1，如果CV值大，这个想象不会被发觉。
另一个推测是容器没有很好的密封，一些加样口或试管里的试剂蒸发了。
7. 定量数据完成初步的实验和分析后，下一步要决定如何有意义地比对数据。
量化mRNA和DNA的标准曲线有时作为绝对量化的参考。
标准曲线允许在质量基础上计算总量未知的样本，但是无论材料浓度的精确性如何，最终结果是相对于一个单位的定义。
大部分设备的软件可以按事先指定的单位计算总量，也可按以下的公式：Log10 copy number = Ct–y-intercept/slope。
重要的是检验你的试剂能够给出100%的反应效率。
没必要指望你的样本里会有一个能给出精确的基因表达测量。
有关规范化和相对量化的内容本文不做展开讨论。
8. 数据统计实验完成了，数据也分析了，还有什么可做的？还有很多，real-time PCR统计与大量参数有关，如实验过程中的细胞收获，核苷酸，提取技术，逆转录，PCR条件和试剂等情况。
使用你的数据之前有必要先进行统计整理。
数据的表达取决于实验的目的，如测试受某因素影响前和后的基因表达，正常细胞对比癌症细胞，时间的影响等等。
另一类如食物、水、环境中的微生物含量，确认生物芯片、siRNA的结果等等。
根据实验的类型，有关数据应该按一定的原则整理有助于读者观察到变化，包括数据含义，标准差，置信区间。
有些统计用于告诉读者存在重大差异的可能性，大多数real-time PCR是检验假设的结果，有时这些差异很明显统计步骤只是走过场。
但是生物系统是不断变化的，不精确的，有时统计能说明数据的排他性。
