亲和层析法纯化胰蛋白酶培训课件

亲和层析法纯化胰蛋白酶一. 实验目的1.理解亲和层析法的基本原理, 并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2.掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。

二. 实验原理亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。

这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。

许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。

这种分子之间的结合能力做亲和力。

亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。

所以有人称为“生物专一吸附技术”。

在实际工作中, 只要把被识别的分子, 称为配基（Ligand）, 在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（如Sepharose4B）制成亲和吸附剂, 然后装柱。

再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子, 这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留, 只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。

当所有的杂质从柱上流走后, 再改变洗脱条件, 使结合在配基上的物质解离下来。

这样, 原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。

本实验为了纯化胰蛋白酶, 采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂。

鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂, 对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用, 但不抑制糜蛋白酶。

在pH=7-8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合, 而在pH=2-3时, 又能被解离下来。

采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从粗提液中通过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶制品, 比用经典分离纯化方法简便得多。

纯化效率可达到10-20倍以上。

1.三. 实验方法步骤2.鸡卵粘蛋白的制备取蛋清60ml, 加入等体积的三氯乙酸丙酮溶液（丙酮: 三氯乙酸=40:60）后, 出现大量白色沉淀, 搅匀后室温静置4h以上, 待清蛋白完全沉淀, 3000rpm离心10min, 弃去沉淀, 47ml上清液倒入250ml锥形瓶并用塑料薄膜封好, 置于冰箱中冰浴片刻, 缓慢加入3倍体积(141ml)的预冷丙酮, 搅匀后冰浴4h直到出现沉淀,用真空泵抽去部分上清液, 剩余部分的部分沉淀和上清液全部转移至离心管中, 以3000rpm下离心15min, 弃上清液。

实验十一亲和层析纯化胰蛋白酶一、引言前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的手段，比起早期采用的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。

但是，这些方法中，或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不同，或是依据其分子的大小和形状的不同。

一句话，多是利用生物分子间物理和化学性质的差异来进行分离纯化的。

由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。

经过许多步骤才能使生物分子达到一定的纯度。

这样既费时间，又费试剂，有时最后产品还不能令人满意。

另外，有些生物大分子，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很多，特别是一些具有生物活性的分子，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成破坏以致失活，产率很低。

这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。

亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法。

它具有分离快速，纯化效率高。

特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。

有时一次被分离物质的纯度可提高几倍，十几倍甚至几百倍。

因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。

二、实验目的与要求1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术；3. 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法。

三、基本原理简言之，亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。

这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。

许多生物分子都有一种独特的生物学功能。

即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。

如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合。

实训亲和色谱纯化胰蛋白酶［任务描述］亲和色谱主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。

鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，在pH7.0～8.0的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH2.0～3.0时，又能被解离下来。

因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和色谱直接获得活力大于10000BAEE单位/毫克蛋白胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多，纯化效率可达到10～20倍以上。

本次实训任务为纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂-鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。

［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。

2.收集亲和色谱纯化胰蛋白酶工作中必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。

3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。

（1）材料准备鸡蛋清，新鲜猪胰脏。

（2）试剂与仪器试剂：丙酮、三氯乙酸、HCl、NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、氯代环氧丙烷、乙腈、甲酸、Tris、CaCl2、KCl、DEAE-纤维素、Sepharose-4B、乙酸二氧六环二甲基亚砜。

主要贮存溶液：①鸡卵粘蛋白色谱液（1L）。

0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液。

②DEAE-纤维素处理液。

0.5mol/L HCl 300mL和0.5mol/L NaOH、0.5mol/L NaCl 各300mL。

③卵粘蛋白洗脱液。

0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液含0.3mol/L NaCl，150mL。

④标准胰蛋白酶溶液。

结晶胰蛋白酶以0.001mol/L HCl 配制成1mg/mL 。

⑤亲和色谱柱平衡液。

含0.5mol/LKCl 、0.05mol/L CaCl 2的0.1mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液500mL （配1000mL ：12.1g Tris ，37.5g KCl ，5.6g CaCl 2）。

亲和层析蛋白纯化
亲和层析蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化方法，利用目标蛋白与具有亲和作用的亲和基团结合，将目标蛋白从复杂的混合物中分离出来。

亲和基团通常是与目标蛋白有特异结合的小分子，如金属离子、抗体、亲和标签等。

在亲和层析过程中，将这种具有亲和基团的亲和剂固定在某种固相材料上，如琼脂糖或磁珠等。

将混合物加入亲和剂固定的层析柱中，目标蛋白与亲和基团结合，其他非特异结合的成分则通过柱子流过。

随后，通过改变缓冲条件或添加竞争性亲和剂，将目标蛋白从亲和基团上进行洗脱，最终得到纯化后的目标蛋白。

亲和层析蛋白纯化方法简单易行，纯化效果好，但也有一些局限性，如亲和基团的选择对纯化效果有很大影响，目标蛋白与亲和基团的结合力可能不够牢固，而且纯化过程中可能会有非特异结合的蛋白质被误纯化。

因此，在选择亲和层析方法时需要根据目标蛋白的特性及需求进行合理选择。

猪胰蛋白酶的亲和层析制备及测定内容提要利用亲和层析（affinity of chromatography）技术纯化胰蛋白酶是一个综合性实验。

首先从鸡卵清中分离胰蛋白酶的天然抑制剂——鸡卵粘蛋白，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶（sepharose-4B）上，制成鸡卵粘蛋白的亲和吸附剂，然后通过亲和层析方法从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋白酶。

本实验要求掌握亲和层析的原理和方法；凝胶层析和离子交换层析技术；酶活性测定方法和抑制活性测定的原理和方法。

原理亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多醣类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。

近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速。

对于那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲和层析技术就显示出其独特的优越性。

亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最佳的方法。

亲和层析是由吸附层析发展起来的，主要是根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的。

所谓亲和力是指：范德华力、疏水力、静电力、氢键等，它存在于某些分子内部，也是维系着某些分子之间的结合力。

酶与底物、酶与抑制剂、抗原与抗体、激素与激素受体等彼此分子之间的结合力就是亲和力。

亲和力是很弱的，只有在彼此分子挨得很近的条件下才显示出来。

所以要求两分子之间的结合具有高度特异的分子基础，即分子间的互补结构。

利用这种具有亲和力的生物分子间可逆的结合和解离的原理发展起来的层析，就称为亲和层析。

它相对于建立在物理化学原理（如分子颗粒大小、分子带电荷状况等）的分离方法而言，可称为“生物专一吸附”的层析分离方法。

在亲和层析过程中，被分离的生物分子在一定的条件下，有选择性地，即高度特异地被结合到共价偶联的不溶性载体的配基亲和吸附剂上，改变原有条件，如选用竞争性抑制剂、底物、辅助因子或采用不同pH的缓冲液、高浓度盐、变性剂等，又可有选择性地从亲和吸附上把被分离物质洗脱下来。

亲和层析法纯化胰蛋白酶一．实验目的1.理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2.掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。

二．实验原理亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。

这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。

许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。

这种分子之间的结合能力做亲和力。

亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。

所以有人称为“生物专一吸附技术”。

在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（Ligand），在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（如Sepharose4B）制成亲和吸附剂，然后装柱。

再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。

当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。

这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。

本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂。

鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。

在pH=7-8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH=2-3时，又能被解离下来。

采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从粗提液中通过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。

纯化效率可达到10-20倍以上。

三．实验方法步骤1.鸡卵粘蛋白的制备取蛋清60ml，加入等体积的三氯乙酸丙酮溶液（丙酮：三氯乙酸=40:60）后，出现大量白色沉淀，搅匀后室温静置4h以上，待清蛋白完全沉淀，3000rpm 离心10min，弃去沉淀，47ml上清液倒入250ml锥形瓶并用塑料薄膜封好，置于冰箱中冰浴片刻，缓慢加入3倍体积(141ml)的预冷丙酮，搅匀后冰浴4h直到出现沉淀,用真空泵抽去部分上清液，剩余部分的部分沉淀和上清液全部转移至离心管中，以3000rpm下离心15min，弃上清液。

亲和层析法纯化胰蛋白酶实验一鸡卵粘蛋白的分离纯化1鸡卵粘蛋白的基本性质1.1鸡卵粘蛋白的组成分子量: 28000Da分子组成:四个分子量相近的亚基组成糖蛋白糖基部分:D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸1. 2.鸡卵粘蛋白的提取2.1提取：每组发给50毫升的鸡卵清加入一定体积的10% pH1.15 TCA溶液(轻轻搅拌一边搅拌一边加入),搅匀后用pH试纸检查pH值,待pH稳定在3.5± 0.2后放置4℃冰箱过夜.2.2离心：转移50毫升离心杯中,于3000rpm 离心15min。

2.3过滤：倾出上清液，滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物2.4调pH值：用1mol/L HCl 将溶液精确调至pH3.5。

量取体积。

2.5丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷的丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。

2.6离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000 rpm离心15min。

2.7除残留丙酮：弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯至于真空干燥器中。

抽去残留丙酮。

（沉淀物的颜色由白变成透明胶状物即可）2.8溶解：加入25ml蒸馏水或20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液溶解，滤纸过滤，收集滤液，备用。

3鸡卵粘蛋白的分离纯化3.1 Sephadex G-25 柱脱盐(1)溶胀：称取15g Sephadex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml 蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。

(2)装柱：取一支30×3cm 的层析柱，将溶胀好的Sephadex G-25装柱，自然沉降。

(3) 处理：用2倍柱床体积的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍体积的蒸馏水洗去残留的NaCl。

(4)平衡：用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0-1.5 ml/min。

紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出稳定的基线。

(5)上样：将柱内的缓冲液液面流至于胶面相切，取20ml鸡卵粘蛋白提取液上样，待样液液面流至于胶面相切，加入2-3ml缓冲液冲洗层析柱内壁，待溶液液面流至于胶面相切，然后加入缓冲液距胶面高度约2-3cm，以同样的流速洗脱。

亲和层析法纯化胰蛋白酶1.3实验流程鸡蛋清Spharose4B猪胰脏↓↓↓提取↓活化提取分离纯化↓↓↓纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose4B胰蛋白酶原粗提液↓↓偶联激活↓↓CHOM-Spharose4B→←胰蛋白酶提取液↓亲和层析↓酶促动力学←纯胰蛋白酶→酶活性测定↓酶蛋白含量测定实验一鸡卵粘蛋白的分离纯化1鸡卵粘蛋白的基本性质1.1鸡卵粘蛋白的组成分子量: 28000Da分子组成:四个分子量相近的亚基组成糖蛋白糖基部分:D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸1. 2.鸡卵粘蛋白的提取2.1提取：每组发给50毫升的鸡卵清加入一定体积的10% pH1.15 TCA溶液(轻轻搅拌一边搅拌一边加入),搅匀后用pH试纸检查pH值,待pH稳定在3.5±0.2后放置4℃冰箱过夜.2.2离心：转移50毫升离心杯中,于3000rpm 离心15min。

2.3过滤：倾出上清液，滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物2.4调pH值：用1mol/L HCl 将溶液精确调至pH3.5。

量取体积。

2.5丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷的丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。

2.6离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000 rpm离心15min。

2.7除残留丙酮：弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯至于真空干燥器中。

抽去残留丙酮。

（沉淀物的颜色由白变成透明胶状物即可）2.8溶解：加入25ml蒸馏水或20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液溶解，滤纸过滤，收集滤液，备用。

3鸡卵粘蛋白的分离纯化3.1 Sephadex G-25 柱脱盐(1)溶胀：称取15g Sephadex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml 蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。

(2)装柱：取一支30×3cm 的层析柱，将溶胀好的Sephadex G-25装柱，自然沉降。