我的cas9总结
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劳伦斯伯克利国家实验室的研究团队发现了一种双链RNA，能指导细菌蛋白在特定位点剪切外源DNA，而且将这种双链RNA改造为单链RNA，能指导细菌蛋白对几乎所有DNA序列进行剪切。
这种RNA引导的双链DNA剪切是细菌获得性免疫系统的核心。细菌和古细菌面临着病毒和质粒的不断攻击，微生物为了生存采用了以CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）为核心的免疫系统。细菌和古细菌能够利用小crRNA分子（CRISPR-derived RNA），结合CRISPR和相关内切酶Cas蛋白（CRISPR-associated蛋白）靶标并摧毁入侵病毒和质粒的DNA。
CRISPR/Cas免疫系统主要有三种类型。第二种类型(完全依赖Cas9内切酶家族来靶标和剪切外源DNA的II型CRISPR/Cas免疫系统。)
这一系统中，crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA。
这一tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA。(1、Cas9蛋白中的HNH核酸酶结构域剪切互补链。2、Cas9 RuvC-like 结构域剪切非互补链。)
目前 Jinek 等发明了一种更新型的 CRISPR/Cas9 系统，将 crRNA和 tracrRNA
2 个序列通过一个 4 碱基的连接环连接起来，构成一个新的 guide RNA，
Hwang 等利用该技术对斑马鱼进行了打靶，他们分别构建了针对 fh 基因的
sgRNA ( Small guide RNA)和编码 Cas9 的 T7 启动子表达载体，体外转录获得
mRNA 后，将 2 种 RNA 按不同比例混合，通过显微注射的方式注入斑马鱼单细胞期的受精卵中。
中国科学家也利用 CRISPR/Cas9 打靶系统对斑马鱼的 etsrp、gata4 和 gata5
基因进行了突变研究，结果发现 35% 的特异位点都成功突变。
整个系统中发挥活性作用的核心部件为 sgRNA 和蛋白质，因此可以通过构建载体，体外转录获得 RNA 后，显微注射动物受精卵而获得打靶动物
Cas9 软件和protocol：/
2、检测cas9系统sgRNA的稳定性（robustness）
10 sgRNAs: 5’-GG-N18-NGG-3
T7
Endonuclease I (T7EI) mutation detection assays
Targeted genomic loci were amplified from genomic zebrafish DNA from single embryos using
primers designed to anneal approximately 150 to 200 base pairs upstream and downstream from
the expected cut site and Phusion Hot Start II high-fidelity DNA polymerase (New England
Biolabs) according to the manufacturer’s instructions. A list of the primers used in this study is
provided in Supplementary Table 5. PCR products were purified with Ampure XP (Agencourt)
according to the manufacturer’s instructions. T7 Endonuclease I assays were performed and
estimated NHEJ frequencies were calculated as previously described1.
DNA Sequencing of Mutated Endogenous Gene Target Sites
Each target locus was amplified by PCR from pooled genomic DNA of ten injected embryos. The
resulting PCR products were cloned into a plasmid using the pGEM-T kit (Promega) or Zero
Blunt TOPO PCR cloning kit (Life Technologies). Following transformation of these reactions,
plasmid DNAs isolated from overnight cultures of single colonies were sequenced by the
Massachusetts General Hospital DNA Sequencing Core. Mutated alleles were identified by
comparison to the wild-type unmodified sequence.Single base substitutions, deletions, or insertions were not designated as mutant alleles because we could not exclude the possibility that
these alterations might also be generated by the PCR amplification process.
To test whether the Cas9/gRNA system can mediate site-specific cleavage in mammalian cells, we
converted bacterial Cas9 cDNA into a humanized Cas9 cDNA by optimizing mammalian codons（哺乳动物密码子优化）,and included nuclear localization signals (NLSs) at both ends of Cas9
to facilitate the entry of Cas9 protein into the nuclei of mammalian cells (Figure 1A). We also
fused crRNA with a normally trans-encoded tracrRNA to form a gRNA that was driven by the
human U6 promoter （将细菌的cDNA变成人的cDNA，然后再加核定位信号NLS,有助于cas9蛋白容易进入人的细胞）
Cas9内切酶在向导RNA的指引下能够对各种入侵的外源DNA分子进行定点切割，不过主要识别的还是保守的间隔相邻基序（proto-spacer adjacent motifs，PAM基序）
Cas9是由crRNA和tracrRNA（反式激活crRNA）引导、切割特定DNA序列的核酸酶。引导RNA（gRNA）可设计成包含发夹结构，以模拟tracrRNA-crRNA复合物。结合特异性是根据gRNA和三核苷酸NGG序列（protospacer adjacent motif，PAM）。对于位点特异的编辑，CRISPR/Cas9系统至少需要Cas9核酸酶和gRNA。
Sigma CRISPRs以单个质粒载体提供，其中包含GFP，可快速富集编辑过的细胞。当然，您也可以利用专门的生物信息学工具在线定制（/crisprs）。
Sigma独有的在线设计工具让用户可根据CRISPR/Cas靶定的要求，识别人、小鼠和大鼠外显子中的最佳靶位点。它能够自动应用CRISPR/Cas最佳设计实践，包括靶位点与基因组中其他位点至少要求3个碱基对不匹配，从而最大限度减少了脱靶效应。
We created reporter and conditional
mutant mice by coinjection of zygotes with Cas9
mRNA and different guide RNAs (sgRNAs)
as well
as DNA vectors of different sizes.
Using this one-step procedure we generated mice carrying a tag or a fluorescent reporter
construct in the Nanog, the Sox2, and the Oct4 gene as well as Mecp2 conditional mutant mice.
设引物将质粒产生的mRNA和细胞内源相应mRNA区分
质粒表达的mRNA是没有3'UTR和5'UTR的，你可以在这两处和CDS上设计一个，然后相减，就是质粒表达的mRNA
在原核细胞中，合成的蛋白能否分泌到细胞外与mRNA编码区上游的一段信号序列有关。这段编码序列翻译的15～30个氨基酸为蛋白质N端的信号肽，它能携带蛋白质跨膜并分泌到细胞外。脂双层和负电荷的质膜通过和信号肽的疏水相互作用以及电荷的吸引是信号肽能跨膜分泌的主要原因。当信号肽携带后面的蛋白质跨膜分泌后，信号肽即被质膜上的信号肽酶切除得到有功能的成熟蛋白质。
因此根据不同的需要，人们构建了不同的在原核细胞中高效表达的载体，这些载体通常具有以下几个特点：①有一个强的原核启动子及两侧的调控序列；②位于读码框上游的SD序列与起始密码子AUG之间有合适的距离；③在外源基因和启动子之间有正确的阅读框架；④外源基因下游应加入不依赖ρ因子的转录终止区。一般表达载体都具有多克隆位点，对表达载体和外源基因用相同的两种酶双酶切后，再用T4 DNA连接酶把外源片段连入表达载体中，通过酶切、PCR鉴定，如果插入的片段大小和方向与外源基因一致，则成功构建了重组子。
将克隆的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
因此根据不同的需要，人们构建了不同的在原核细胞中高效表达的载体，这些载体通常具有以下几个特点：①有一个强的原核启动子及两侧的调控序列；②位于读码框上游的SD序列与起始密码子AUG之间有合适的距离；③在外源基因和启动子之间有正确的阅读框架；④外源基因下游应加入不依赖ρ因子的转录终止区。一般表达载体都具有多克隆位点，对表达载体和外源基因用相同的两种酶双酶切后，再用T4 DNA连接酶把外源片段连入表达载体中，通过酶切、PCR鉴定，如果插入的片段大小和方向与外源基因一致，则成功构建了重组子。
