蛹虫草HWM剩余物蛋白酶解工艺研究

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蛹虫草多肽的提取及体外抗氧化活性研究

蛹虫草多肽的提取及体外抗氧化活性研究采用酶解法获取蛹虫草子实体中的多肽，并对中性蛋白酶和木瓜蛋白酶提取出的蛹虫草多肽进行体外抗氧化活性的测定。

结果表明，蛹虫草多肽具有一定的还原能力、清除DPPH的能力和清除羟自由基的能力，并且采用木瓜蛋白酶提取出的多肽活性均优于用中性蛋白酶提取出的多肽。

这为以后蛹虫草多肽在医学、食品及保健品等领域广泛应用提供了重要理论基础。

标签：蛹虫草；多肽；蛋白酶；抗氧化0 引言蛹虫草[Cordyceps militaris（L.）Link]是一种和冬虫夏草同属异种的药食兼用真菌，又名北冬虫夏草。

研究表明蛹虫草含有与冬虫夏草相近的功能物质及药用功效[1]。

蛹虫草含有蛋白质、虫草酸、脂肪、SOD酶、虫草素、虫草多糖和很多微量元素。

众所周知，多肽是机体完成各种生理活性必不可少的一种物质，在生物的代谢活动和疾病治疗中也有着举足轻重的作用，因此该研究现已成为一大热点[2]。

但目前国内外的学术研究，有关蛹虫草多肽内容的很少，大部分都围绕虫草素和虫草多糖的研究。

本文对蛹虫草子实体中多肽的提取、及体外抗氧化活性进行研究，旨在为日后蛹虫草多肽类物质的研究及其应用提供参考意见。

1 材料与仪器1.1 材料与试剂蛹虫草子实体、30%过氧化氢溶液、无水乙醇、硫酸亚铁、水杨酸、蒸馏水、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、DPPH、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶。

1.2 仪器设备粉碎机、恒温水浴锅、分光光度计、离心机、电子天平、筛子、锥形瓶等。

2 实验方法2.1 多肽的提取将蛹虫草磨成粉用筛子过滤后，取6个150ml锥形瓶加入10 g虫草粉、90ml 蒸馏水，三个分别加0.5 g木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，室温下充分溶胀30min后放入恒温水浴锅中3 h，调节温度为55 ℃和50 ℃。

酶解完成后沸水浴煮沸10 min，离心（4000 r/min）10 min得上清即为肽类物质。

2.2 蛹虫草多肽体外抗氧化活性研究2.2.1 蛹虫草多肽对羟自由基清除能力的测定采用水杨酸法测定。

生产蛹虫草蛋白的微生物发酵技术研究进展

生产蛹虫草蛋白的微生物发酵技术研究进展蛹虫草是一种珍贵的中药材，具有广泛的药用价值。

在蛹虫草中，蛹虫草蛋白是一种重要的功能性成分，具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等多种作用。

然而，传统蛹虫草药材的采集难度大，来源有限，因此开发生产蛹虫草蛋白的微生物发酵技术成为解决该问题的重要途径。

本文将介绍一些近年来在蛹虫草蛋白微生物发酵技术方面的研究进展。

一、蛹虫草蛋白的生物合成途径蛹虫草蛋白的生物合成途径是蛹虫草蛋白微生物发酵技术的核心。

目前已有多种途径被报道，其中最为常用的是利用真菌或细菌进行发酵合成。

例如，将蛹虫草的菌丝或孢子接种在合适的培养基中，通过控制培养条件，如温度、pH值、氧气供应等，诱导菌丝或孢子进行蛹虫草蛋白的合成。

此外，也有研究利用基因工程技术，将蛹虫草蛋白的基因导入到其他微生物中，通过调控基因表达来合成蛹虫草蛋白。

二、微生物菌株的选择与改良微生物菌株的选择与改良是蛹虫草蛋白微生物发酵技术的重要环节。

不同的微生物菌株对培养环境的适应性和蛹虫草蛋白合成能力存在差异，因此选择合适的微生物菌株非常关键。

近年来，很多研究关注于寻找具有高产蛹虫草蛋白能力的微生物菌株，并通过菌株改良来提高蛹虫草蛋白的产量和质量。

例如，通过体外诱变、基因工程等手段，改良微生物菌株的遗传背景，提高蛹虫草蛋白的生物合成效率。

三、培养基的优化与配方调控培养基的优化与配方调控是蛹虫草蛋白微生物发酵技术中的关键环节。

培养基的组成对蛹虫草蛋白的合成效率和产量具有重要影响。

研究者通过调节培养基中营养物质的浓度、添加辅助剂和增强剂等手段，优化培养基的配方，提高微生物的生长速率和蛹虫草蛋白的合成效率。

同时，还可以利用统计学方法对培养基进行优化设计，从而达到更高的产量和质量。

四、发酵条件与控制策略发酵条件与控制策略是蛹虫草蛋白微生物发酵技术的关键环节。

研究者通过调节发酵温度、氧气供应、pH值、发酵时间等参数，优化发酵条件，最大限度地提高蛹虫草蛋白的产量和质量。

蛹虫草液态深层发酵的研究

β-蜕皮激素对蛹虫草液体发酵有明显的促进效应,在培养过程中测定发现,各处理组菌丝体产量7 d后达到最大值,与对照相比,β-蜕皮激素添加量为 1.2 mg/l时,胞内多糖产量增加了29.2％；添加量为4mg/l时,单位重量菌丝体的虫草素含量和虫草素产量增加了65.4％和84.7％；添加量为12 mg/l时,菌丝体、单位重量菌丝体的胞外多糖分泌量和胞外多糖产量增加了18.5％、181.7％和63.2％,显著超过了对照组。在本试验范围内若不考虑β-蜕皮激素的处理浓度,单就β-蜕皮激素对蛹虫草液体培养效果的影响,虫草素产量>胞外多糖产量>胞内多糖产量>菌丝体产量。
11.周广麒蛹虫草的液体培养(发酵)技术[期刊论文]-中国食物与营养 2000(02)
12.金永日.苑贵华.李崇靖蚕蛹虫草和冬虫夏草中的D-甘露醇分析 1992(01)
13.李雪芹.包天桐.王雁比色法测定冬虫夏草中甘露醇的含量[期刊论文]-中草药 1999(01)
相似文献(10条)
1.期刊论文施明珠.李有贵.李增智.钟石.胡桂燕.计东风.SHI Ming-Zhu.LI You-Gui.LI Zeng-Zhi.ZHONG Shi.HU
７２ｈｏｕｒｓａｎｄ４２．３ｇ／Ｌａｆｔｅｒ９６ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅａｄｅｎｏｓｉｎｅｗａｓ０．３２５弘ｇ／奢ａｎｄｔｈｅｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｗａｓ
０．１３４弘ｇ／ｇｉｎｔｈｅｗｅｔｍｙｃｅｌｉｕｍｏｆ０．１７９ｐｇ／抽Ｌａｎｄ０．１０２ｐｇ／ｍＬｉｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎｒｅｓｐｅｃｔｉＶｅｌｙａｆｔｅｒ７２ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅｃｏｒｄｙｃｅｐｉｃａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔｗａｓ２３．４０６ｍｇ／套ｉｎｔｈｅｗｅｔｍｙｃｅｌｉｕｍａｎｄ６．６１ｍｇ／ｍＬｉｎ

复合酶法提取蛹虫草类胡萝卜素工艺优化及其抗氧化能力测定

第4期
周翔宇等:复合酶法提取蛹虫草类胡萝卜素工艺优化及其抗氧化能力测定
Байду номын сангаас
81
is 4.096 U/mg. In other words, the antioxidant activities of cordyceps militaris carotenoids obtained by the two extraction methods were not significantly different in vitro.
样品制备的方法参照邵颖等[21] 的方法并进行改进。新鲜蛹虫草子实体于 60 ℃ 下烘干至恒重，粉碎过 60 目筛，低温干燥避光条件下密封保存备用。 1.3.2 提取溶剂的确定
为使得样品定量测定时溶剂体系与标准品保持一致，以便用酶标仪直接测定样品提取液吸光度时直接定量。本实验以溶解度为表征，参照 Dong 等[9] 的方法用乙醇溶液对色素粗提物进行溶解度试验，结果显示其在体积分数为 60% 以下的乙醇溶液中具有良好的溶解性。再选择丙酮、乙醇、甲醇、二甲亚砜（DMSO）、乙腈、60% 乙醇溶液和丙酮与 60% 体积分数的乙醇混合溶液（2∶1）作为研究对象，将蛹虫草子实体色素粗提物分别溶解于上述 7 种溶剂中，最终通过颜色辨别判断其溶解性从而确定最佳提取溶剂。结果显示丙酮和 60% 体积分数的乙醇混合溶液（2∶1）能够溶解标准品 β-类胡萝卜素，同时蛹虫草子实体当中的类胡萝卜素在其中能够很好地提取出来，因而最终确定本试验开展的提取溶剂为丙酮和 60% 体积分数的乙醇混合溶液，两者的比例为 2∶1，在此条件下提取得率最高，为2 256 μg/g。 1.3.3 复合酶的选择以及添加比例的确定
法的原理主要是利用生物酶破坏细胞壁结构从而将色素较温和且带有选择性地释放出来[14]，生物酶的专一性保证其不会对底物外物质造成破坏，这一特性使酶辅助提取法更适合于提取稳定性较差且含量较低的化学成分[15 − 16]。2019 年国内学者汪建红[17] 利用木瓜蛋白酶辅助提取荸荠当中的色素，高效的获得荸荠色素且其稳定性较高。除此之外，采用酶辅助提取法相对于其他常规溶剂提取法拥有更多的优点，提取过程对环境十分友好，提取效率更高，对提取设备及环境的要求更低且能耗低，开展性较强适应于工业化生产[18]。采用酶辅助提取法提取色素有许多优势，但单一的酶可能不能满足要求，所以有的研究者尝试用两种以上的酶采用复合酶提取法提取色素。 2019 年国外学者 Gizem 等[19] 采用纤维素酶和果胶酶共同作用提取土豆废弃基质中的番茄红素并对其提取工艺进行了优化。

蛹虫草培养基中虫草素分离提取的工艺综述

蛹虫草培养基中虫草素分离提取的工艺综述摘要：查阅了相关文献，对蛹虫草的化学成分及其药理作用、蛹虫草培养基的配制及蛹虫草的栽培作了简介。

对虫草素的物化性质及生理活性作了详细综述，并对虫草素分离提纯在国内外研究动态进行了介绍，从而为从蛹虫草培养基中分离虫草素的新工艺提供了分析资料。

关键词：蛹虫草培养基；虫草素；分离提取一、蛹虫草（一）蛹虫草的化学成分蛹虫草又名北冬虫夏草，与我国名贵中药材冬虫夏草为同属异种，属于真菌界子囊菌门麦角菌科虫草属。

在我国主要分布于吉林、河北、四川、湖南、湖北及山西等省。

北方民间曾把它当作冬虫夏草应用，《新华本草纲要》记载其“性平，味甘，有益肺肾，补精髓，止血化痰”。

用于肺结核、老人虚弱和贫血等症状，为珍贵的中药材。

国内外学者对其化学成分、生理活性进行了较系统的研究，也从中分得了大量单体化合物。

姜泓等从其子实体中分离出7个化合物，分别鉴定为3ˊ-脱氧腺苷，腺苷、N6-甲基腺苷、O5-乙酰基虫草素、N6-[β-（乙酰胺甲酰）氧乙基]腺苷、虫草环肽A和麦角甾醇过氧化物。

实体中还包括虫草酸（D-甘露醇）、虫草多糖等多种有效成分，其中Zn/Cu=4.3，为人参的1.4倍，为黄芪等补益药的2.8倍。

核苷类衍生物是蛹虫草重要的活性成分，虫草素是虫草最重要的活性成分之一，是虫草中的一种腺苷类结构类似物，具有显著的药理作用。

（二）蛹虫草的药理作用蛹虫草由虫草属真菌寄生在鳞翅目、鞘翅目及双翅目的一些昆虫的蛹或幼虫体上，使虫体僵死，抽生出子座而形成的。

对它的药理作用方面，2006年文庭池进行了比较详细的概述，认为蛹虫草具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等作用。

中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。

蛹虫草含有8种维生素，具有调节神经系统的作用，对植物神经系统具有外周抗胆碱作用，能降低副交感神经兴奋性。

蛹虫草子座培养剩余基质中虫草素提取工艺的优化

蛹虫草子座培养剩余基质中虫草素提取工艺的优化孟胜楠;杜双田;简利茹;徐鸿雁;张园园;张疏雨【摘要】[目的]优化蛹虫草子座培养剩余基质中虫草素的提取工艺.[方法]以蛹虫草子座培养剩余基质为材料,采用二次通用旋转组合设计,研究提取温度、提取时间、液料比及提取液pH对虫草素提取得率的影响,建立虫草素提取得率与4个因素间的关系模型,分析其单因子和交互影响效应,通过参数优化得到虫草素的最佳提取工艺条件.[结果]4个因素对虫草素提取得率的影响大小依次为液料比＞提取温度＞提取液pH＞提取时间.在最佳提取工艺条件下,即提取温度为63.3℃、提取时间为4.8h、液料比为36.8、提取液pH为6.7时,虫草素得率可达1.32‰.[结论]获得了从蛹虫草子座培养剩余基质中高效提取虫草素的优化工艺.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(041)010【总页数】7页(P131-136,142)【关键词】蛹虫草;子座培养剩余基质;虫草素;二次通用旋转组合设计【作者】孟胜楠;杜双田;简利茹;徐鸿雁;张园园;张疏雨【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】R284.2蛹虫草(Cordyceps militarys)，又名北冬虫夏草，简称北虫草，隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)，核菌纲(Pyrenomycetes),麦角菌目(Clavicipitales)，麦角菌科(Claviciptiaceae)，虫草属(Cordycps)，与冬虫夏草(Cordyeeps sinensis)同属异种[1]。

酶解蚕蛹蛋白工艺的研究及产物分析

酶解蚕蛹蛋白工艺的研究及产物分析
赵鹏;董秀萍;叶楠;朱蓓薇
【期刊名称】《大连工业大学学报》
【年(卷),期】2005(024)002
【摘要】报道了酶法水解蚕蛹蛋白工艺的实验研究,并对水解产物进行了分析.实验中选用已确定的中性蛋白酶和动物蛋白酶对蚕蛹蛋白水解.结果表明,最佳酶解条件为:温度50℃,pH7.0,底物蚕蛹蛋白的质量分数1.0%,动物蛋白酶加量150U/g,中性蛋白酶与动物蛋白酶酶活比为4:1,水解时间3 h,在此条件下水解度为27.36%,酸溶性肽得率为55.17%,相对分子质量分布于336～638.
【总页数】5页(P123-127)
【作者】赵鹏;董秀萍;叶楠;朱蓓薇
【作者单位】大连轻工业学院,生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034;大连轻工业学院,生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034;大连轻工业学院,生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034;大连轻工业学院,生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034
【正文语种】中文
【中图分类】TQ936
【相关文献】
1.具有DPPH自由基抑制活性的蚕蛹蛋白酶解液脱色工艺优化 [J], 农珍妮;赵钟兴;韦藤幼;覃欢欢;杨武
2.蚕蛹蛋白酶解产物体外抗氧化和降血压活性筛选及响应面工艺优化 [J], 赵钟兴;
廖丹葵;孙建华;黄科林;孙果宋;秦伟嘉;吴志洪;童张法
3.酪蛋白酶解制备酪蛋白磷酸肽研究Ⅱ.产物分析及反应动力学模型 [J], 齐崴;何志敏;史德青
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5.蚯蚓蛋白酶解工艺及其产物分析 [J], 刘波;谢骏;郑小平;戈贤平
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蛹虫草胞外酶水解蛋清工艺优化

ｏｆｍｙｃｅｌｉａｏｆＣｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｂｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄ，ｄａｙｓｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ６ｄａｙｓ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｒｅ：ａｄｄｉｎｇａｍｏｕｎｔｏｆｅｎｚｙｍｅｉｓ８．７１％，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｓ５．０６％，ｐＨｉｓ６．０８，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｉｓ６．１３ｈ，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｓ３０．７９℃ ．Ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｄｅｇｒｅｅｏｆｈｙｒｏｄｌｙｓｉｓｗａｓ２９．８６７７％．Ｆｉｎａｌｌｙ．ＳＤＳ —ＰＡＧＥｅｘｐｅｉｍｅｒｎｔｗａｓｃａｒｄｅｄｏｕｔｔＯｖｅｉｆｒｙｔｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌｒａｗｅｉｇｈｔａｎｄｈｅｔｈｙｒｏｄｌｙｓｉｓｏｆｅｇｇｗｈｉｔｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｅｘｏｅｎｚｙｍｅ｝ｅｇｇｗｈｉｔｅｐｒｏｔｅｉｎ；ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

蛹虫草培养基残余体综合利用的研究进展

dible蛹虫草[Cordyceps militaris（L.）Link]又名北冬虫夏草、北虫草，与冬虫夏草同属异种。

由于其主要药用成分虫草素含量比冬虫夏草高得多，大约为后者3~5倍甚至10倍[1]，且蛹虫草更容易人工栽培，因此蛹虫草目前被选为冬虫夏草的最佳替代品。

我国蛹虫草子实体的生产已有相当规模，在子实体收获后产生大量废弃的培养基残余体作为废弃物被扔掉。

这不仅污染环境而且造成很大浪费。

废弃的培养基中含有丰富的菌丝体，其中还有大量的虫草素和腺苷及多糖类等活性物质[2]。

如何利用好虫草培养基残余体不仅能提高蛹虫草生产的附加值，也能解决环保问题，具有重要的经济效益和生态效益。

因此，近年来虫草培养基残余体的综合利用研究备受关注。

笔者从虫草培养基残余体的虫草素、虫草多糖的提取纯化，在保健食品和饲料中的应用及作为杀虫真菌制剂或用于培养其它微生物等方面综述了虫草培养基残余体综合利用的研究进展。

1蛹虫草培养基残余体中虫草素、虫草多糖的提取纯化蛹虫草性味甘平，益肺肾，补精髓，止血化痰，用于肺结核、老人虚弱、贫血虚弱等，是一种名贵的中药和高级滋补品，其中虫草素、虫草多糖是蛹虫草的重要活性成分[3]，虫草素在美国作为抗癌新药，已经进入三期临床，具有极高的医药经济价值。

目前，虫草素主要从蛹虫草子实体中提取。

但是，由于蛹虫草子实体的生产成本高，从而导致虫草素的生产成本极高。

研究发现，人工栽培蛹虫草培养基中含有大量的虫草素，与相应的子实体相比，培养基来源充足，价格低廉，作为制备虫草素的原料，可以大大降低成本[4]-[5]。

因此，近年来虫草培养基残余体中虫草素、虫草多糖的提取纯化的研究备受研究者关注。

1.1蛹虫草培养基残余体中虫草多糖、虫草素的提取根据虫草素和虫草多糖溶于水、热乙醇和甲醇的性质，其提取一般采用水、50%乙醇、乙醇和甲醇等溶剂。

提取方法主要有水浴煎煮法、热水回流提取法、索氏提取法、超声波辅助提取法、微波法浸提法、连续逆流提取法等。

蛹虫草蛋白质的碱法提取工艺

2 结果与讨论
第一作者：硕士研究生（余宙教授为通讯作者）。收稿日期： 2012 － 09 － 06，改回日期： 2012 － 11 － 27
2. 1 原料白
2012 年第 38 卷第 12 期（总第 300 期） 185
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
的含量为 28. 7% 。 2. 2 牛血清蛋白标准曲线
图 1 牛血清蛋白标准曲线
结果表明，蛋白吸光度值在 15 ～ 150 μg / mL 浓度内线性关系良好，回归方程为： Y = 5. 413 8X + 0. 036 2，R2 = 0. 997 9。
经过精密度实验、稳定性实验、重复性实验、加样回收率实验表明，该方法用于测定蛹虫草中的蛋白质含量可靠、稳定。 2. 3 单因素实验结果与分析 2. 3. 1 NaOH 溶液的浓度对蛹虫草蛋白得率的影响
蛹虫草（ Cordyceps militaris），又名北冬虫夏草，蛹草，蛹草菌等，为卫生部公布的新资源食品，分类学上属于真菌门（ Eumycota ），子囊菌亚门（ Ascomycotinia），核菌纲（ Pyrenomycetes），球壳目（ Sphaeriales），麦角菌科（ Claviciptiaceae），虫草属（ Cordycps）［1］。研究表明蛹虫草含有丰富的蛋白质，有的甚至高达 39% ，人体必需氨基酸的种类齐全、比例适当，占氨基酸总量的 35. 47% ；同时含有 VA ，VB2 ，VE ，VC ，VB1 ，VD ，VB6 和菸酸［2］，以及含有虫草素、虫草多糖、腺苷、甘露醇、麦角甾醇等药理成分［3］。临床研究表明，蛹虫草具有免疫调节、抗疲劳、抗肿瘤［4 －5］、抗衰老、耐缺氧、降血压、降血脂、镇静催眠、保护心脑组织等药理作用［6 －7］。

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蛹虫草HWM 剩余物蛋白酶解工艺研究徐鸿雁孟胜楠张疏雨张园园杜双田*（西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100）摘要以酶解液多肽指数为指标，选用胃蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及蜗牛酶、纤维素酶水解蛹虫草HWM 剩余物，筛选蛹虫草HWM 剩余物蛋白酶解最佳用酶。

采用二次回归正交试验确定其最佳酶解工艺。

试验结果表明，碱性蛋白酶为蛹虫草HWM 剩余物蛋白降解的最佳用酶，其最佳酶解工艺参数为反应时间12h ，加酶量为干基底物质量的10%，底物质量浓度70mg/mL ，酶解温度55℃，初始pH 12.0。

在此条件下，蛹虫草酶解液多肽指数达90.32%。

关键词蛹虫草HWM 剩余物；酶解工艺；TCA-SN%文章编号1009-7848（2014）04-0127-09蛹虫草（Cordyceps militaris ），也称北冬虫夏草，隶属子囊菌亚门（Ascomycotina ），核菌纲（Pyrenomycetes ），麦角菌科（Clavicipitaceae ），虫草属（Cordyceps ），与冬虫夏草（Cordyceps sinensis ）同属不同种[1]。

大量研究资料表明，蛹虫草和冬虫夏草具有相同的化学成分和相似的药理作用[2-4]。

其药用成分包括虫草素、甘露醇、超氧化物歧化酶、虫草多糖等，具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化等多种功效[5-10]。

目前蛹虫草的研究多集中在虫草素、虫草多糖提取方面，对于蛹虫草子座蛋白及肽类物质的研究较少。

钱康南等[11]将蛹虫草子座粉经蒸馏、分离脱脂后，采用酶解技术制得1种抗肿瘤功能肽；Wong [12]、Byung [13]、Xian [14]、梁坚[15]等相继对蛹虫草蛋白及多肽活性进行了研究，结果表明，蛹虫草蛋白及多肽都具有一定的抗癌和增强机体免疫力的作用；韩晨等[16]采用中性蛋白酶酶解蛹虫草，超临界萃取（supercritical fluid extraction ，SFE ）残渣，测得蛹虫草酶解液的还原力A700达0.465。

本文拟探讨不同蛋白酶对蛹虫草热水浸提（hot water extraction method ，HWM ）剩余物———蛋白成分的酶解能力，筛选蛹虫草HWM 剩余物蛋白降解的最适用酶，并采用二次回归正交试验方法，旨在确定蛹虫草HWM 剩余物蛋白酶解的最佳工艺参数，为蛹虫草蛋白资源综合利用提供科学依据。

1材料与方法1.1材料与试剂蛹虫草HWM 剩余物为热水浸提虫草素后所得残渣（凯氏定氮法测定得剩余物蛋白质含量为24.795g/100g ）；蛹虫草子座由西北农林科技大学生命科学学院提供；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、蜗牛酶、纤维素酶，西安沃尔森生物技术有限公司；牛血清白蛋白，北京奥博星生物技术有限公司；其他所用化学试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备FA-1104电子天平，上海精密科学仪器有限公司；TDA-2002电子恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；V-1100D 紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；SHB-Ⅲ真空泵，郑州长城科工贸有限公司；TGL-16G 高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；CT-6021A 酸度计，上海天磊仪器仪表有限公司。

1.3方法1.3.1酶解液的制备称取蛹虫草HWM 剩余物1g 于50mL 锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物质量浓度，用氢氧化钠和盐酸溶液调节至设定的pH收稿日期：2013-04-14基金项目：陕西省科技统筹创新工程计划项目（2011KTCL02-16）作者简介：徐鸿雁，女，1988年出生，硕士生通信作者：杜双田Vol．14No．4Apr ．2014Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology中国食品学报第14卷第4期2014年4月中国食品学报2014年第4期值，按设定的加酶量比例（为占蛹虫草干基质质量分数，下同）加入蛋白酶，于适宜温度条件下进行酶解，反应结束后沸水浴10min ，抽滤，滤液冷藏备用。

1.3.2试验设计1.3.2.1酶种类筛选本试验考虑酶的性质及其适用条件，初步选择木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶和蜗牛酶、纤维素酶5种酶对蛹虫草HWM 剩余物进行单一和复合处理。

复合处理时，先用蜗牛酶和纤维素酶分别酶解1.5h ，然后重新调节溶液底物质量浓度和pH 值，加入单一酶解筛选出的蛋白酶酶解4.5h ，其他酶解反应条件见表1。

以蛹虫草酶解液多肽指数为指标筛选酶种类。

蛋白酶种类底物质量浓度/mg ·mL -1加酶量/%酶解温度/℃反应时间/hpH 胃蛋白酶305376 2.8木瓜蛋白酶305606 6.5碱性蛋白酶30547610蜗牛酶30537 1.5 6.5纤维素酶305601.55.5表1酶处理基本条件Table 1Basic conditions of treat with protease1.3.2.2单因素试验采用1.3.2.1节筛选出的蛋白酶，研究反应时间、底物质量浓度、加酶量、反应温度、初始pH 值5个因素对蛹虫草酶解液多肽指数的影响。

1）反应时间试验精确称取蛹虫草HWM 剩余物1g 于50mL 锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物质量浓度为20mg/ml ，按5%的加酶量加入蛋白酶，在蛋白酶最适pH 值、最适温度条件下分别反应2，4，6，8，10，12h ，反应结束后沸水浴加热10min 灭酶，趁热抽滤，滤液冷藏备用。

考察反应时间对蛹虫草酶解液多肽指数的影响，每个试验重复3次。

2）加酶量试验精确称取蛹虫草HWM 剩余物1g 于50mL 锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物质量浓度为20mg/ml ，分别按2%，4%，6%，8%，10%的加酶量加入蛋白酶，在蛋白酶最适pH 值、最适温度条件下反应8h 后沸水浴加热10min 灭酶，趁热抽滤，滤液冷藏备用。

考察加酶量比例对蛹虫草酶解液多肽指数的影响，每个试验重复3次。

3）底物质量浓度试验精确称取蛹虫草HWM 剩余物1g 于50mL 锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物质量浓度分别为20，40，60，80，100mg/mL ，按5%的加酶量加入蛋白酶，在蛋白酶最适pH 值、最适温度条件下反应8h 后沸水浴加热10min 灭酶，趁热抽滤，滤液冷藏备用。

考察底物质量浓度对蛹虫草酶解液多肽指数的影响，每个试验重复3次。

4）反应温度试验精确称取蛹虫草HWM 剩余物1g 于50mL 锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物质量浓度为20mg/ml ，按5%的加酶量加入蛋白酶，调节至蛋白酶最适pH 值，分别在41，48，55，62，67℃条件下反应8h 后沸水浴加热10min 灭酶，趁热抽滤，滤液冷藏备用。

考察反应温度对蛹虫草酶解液多肽指数的影响，每个试验重复3次。

5）初始pH 值试验精确称取蛹虫草HWM剩余物1g 于50mL 锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物质量浓度为20mg/ml ，按5%的加酶量加入蛋白酶，调节溶液初始pH 值分别为8，9，10，11，12，在蛋白酶最适温度条件下反应8h 后沸水浴加热10min 灭酶，趁热抽滤，滤液冷藏备用。

考察初始pH值对蛹虫草酶解液多肽指数的影响，每个试验重复3次。

1.3.2.3酶解工艺参数确定根据单因素试验结果，以反应时间X 1（h ）、加酶量X 2（%）、底物质量浓度X 3（mg/mL ）、反应温度X 4（℃）、初始pH 值X 5为试验因素，以酶解液多肽指数为指标，进行二次回归正交试验。

试验因素水平编码见表2。

128第14卷第4期r （x 2i ）12.01090.06912.01（x 0i +Δi ）11.39.186.56411.30（x 0i ）10.07.580.05510.0-1（x 0i -Δi ）8.7 5.973.5468.7-r （x 1i ）8.0 5.070.0418.0Δj1.29 1.6 6.59.05 1.3X j =（x j -x 0j ）/ΔjX j =0.78x j -7.76X j =0.63x j -4.69X j =0.15x j -12.31X j =0.11x j -6.08X j =0.77x j -7.69X 1/h X 2/%X 3/mg ·mL -1X 4/℃X 5水平因素表2正交试验因素及水平编码表Table 2Factors and code levels of experiments1.3.3酶解液多肽指数测定采用TCA-SN%法测定[17]。

取2.5mL 样品溶液，加入2.5mL 10%的三氯乙酸（TCA ），静置10min ，4000r/min 离心15min ，弃去沉淀，测定上清液中蛋白质浓度，进而求得酶解液多肽指数。

酶解液多肽指数按下公式进行计算：TCA-SN %=C ×V m×100%式中，TCA-SN%———蛹虫草酶解液多肽指数（%）；C ———蛋白质质量浓度（mg/mL ）；V ———10%TCA 体积（mL ）；m ———蛹虫草HWM 剩余物质量（g ）。

1.3.4蛋白质质量浓度测定采用双缩脲法测定[18]，以吸光度（Y ）与牛血清白蛋白质量浓度（X ）（mg/mL ），作标准曲线，得回归方程为：Y =0.0177X -0.021（R 2=0.9904）。

1.4数据处理每份样品重复测定3次，取其平均值。

以DPS（Version 7.05）统计软件对试验数据进行分析。

2结果与分析2.1蛋白酶筛选由图1可见，单一酶解时，碱性蛋白酶对蛹虫草HWM 剩余物的酶解效果最好，酶解液多肽指数达53.60%，其次是胃蛋白酶；复合酶解时，相比碱性蛋白酶单一酶解，蜗牛酶、纤维素酶的辅助可使酶解液多肽指数分别提高8.6%和8.49%。

这表明辅助酶的加入能提高多肽得率。

综合考虑蛋白酶效益及工艺，最终选用碱性蛋白酶作为制备蛹虫草多肽的酶。

2.2蛹虫草HWM 剩余物蛋白酶解单因素试验2.2.1反应时间的确定由图2可知，酶解液多肽指数在8h 以内增加速率很快，之后随着反应时间的延长，多肽指数缓慢增加。

最终确定碱性蛋白酶酶解蛹虫草的反应时间为8h 。

2.2.2加酶量的确定由图3可知，酶解液多肽指数随着加酶量的增大而升高，加酶量在4%~6%时酶解液多肽指数增加较快，之后缓慢增加，6%时达到最大值。

初步确定碱性蛋白酶酶解蛹虫草的最佳加酶量为5%~7%。

2.2.3底物质量浓度的确定由图4可知，蛹虫草酶解液多肽指数随着底物质量浓度的增大呈现先增加后减小的趋势，在底物质量浓度为60mg/mL 时达到最大值。

最终确定碱性蛋白酶酶解蛹虫草的底物质量浓度为60~70mg/mL 。

2.2.4反应温度的确定由图5可知，酶解液多肽指数在55℃左右达到最大值，升高或者降低温度都会导致多肽指数的降低。