大型真菌标本的采集

野外大型真菌识别、标本采集和室内分离一、目的与要求1、掌握野外标本采集的方法和注意事项2、认识常见的大型真菌。

二、实验原理大型真菌以夏秋多雨时的七、八月份出现最多（春季发生的菌类比较少，仅盘菌目中的羊肚菌、马鞍菌和丛耳菌等多发生于春末），所以此时采集标本最为适宜。

担子菌门是一群多种多样的真菌，约1.6万种。

其特征：①菌丝具横隔，有单核菌丝和双核菌丝（又称初生菌丝和次生菌丝），担孢子萌发时形成单核菌丝，单核菌丝接合，核不结合而形成双核菌丝。

双核菌丝时期相当长。

②形成担子、担孢子，在此过程中有锁状连合。

担子菌分为四纲：①层菌Hymenomycetes，如银耳、木耳、灵芝、蘑菇等。

②腹菌纲Gasteromycetes，如马勃、鬼笔等。

③锈菌纲。

④黑粉菌纲。

泰山常见药用蕈菌有：茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf.、灵芝Ganoderma lucidum (Leys. ex Fr.) Karst．、蜜环菌Armillaria mellea (Vahl. ex Fr.) Kummer．、脱皮马勃Lasiosphaera fenzlii Reich.、猪苓Polyporus umbellatus (Pers.) Fr.、雷丸Polyporus mylittae Cook. et Mass.、猴头菌Hericium erinaceus (Bull. ex Fr.) Pers.、云芝Coriolus versicolor (Fr.) Fr.、银耳Tremella fuciformis Berk、木耳Auricularia auricular (L. ex Hook.) Underw．、紫芝Ganoderma japonicum (Fr.) Lloyd．、大马勃Calvatiagigantean (Batsch ex Pers) Lloyd.、紫色马勃C. lilacina (Mont. et Berk.) Lloyd.等。

实验五、真菌标本采集与制作（腐生菌、寄生菌和共生菌的认识）一、实验目的1、了解和掌握腐生菌、寄生菌和共生菌的生活习性和采集、保存方式2、掌握真菌标本的采集和保存方式二、实验材料1、植物病原真菌干标本2、大型真菌干标本3、大型真菌浸渍标本三、实验内容1．真菌的分布根据真菌生境和生活方式不同可将其分为：（1）水生真菌：在水中腐生于动植物尸体上，有的寄生于动植物上，危害水中动物，如水蕾属（Saprolegnia）。

（2）地生真菌：这类真菌的种类较多，生活环境不同，庭院、公园、草原等地都可生长。

（3）木生真菌：有的寄生于活立木上，危害林中树木，形成森林病害；有的腐生于枯立木、倒木或伐木桩上，有利于清除林中垃圾，成为“林中清道夫”。

（4）病害真菌：这类真菌寄生于人、动物及各种农作物体上，使人、动物及农作物患病。

（5）共生真菌：真菌与藻类共生形成地衣；密环菌和天麻共生；接合菌、伞菌、担子菌与高等植物形成菌根。

2．真菌标本的采集制作（1）采集用具平底背筐，平底手提筐，纸盒若干个（或铝盒、小指管若干个，塑料袋若干个），木箱1～2个，液浸标本筒1～2个，掘根器，刨根器，手锯，短刀，刀片，白纸，纱布，号牌，线或细绳，钢卷尺，湿度计，温度计，pH试纸，测高计等。

（2）采集方法空气、土壤或动植物体上的真菌多属于霉菌，采集这类真菌常用分离或纯培养方法得到。

而伞菌、多孔菌、盘菌、锈菌、黑粉菌、银耳等各种真菌的采集方法如下：①地生真菌采集：采集时用手轻轻捏住菌柄基部，缓慢将菌体旋转一周，然后拔出，尽量带出地下部分，抖掉泥土。

采集时注意保持菌体的完整性，不要损伤各部，以免给鉴定带来困难。

有些菌类的菌柄在土中埋的很深，需用刀或掘根器挖出来。

有些伞菌柄的基部，盘菌和腹菌基部，有菌索伸入土中，注意一起采取。

②木生真菌采集：可用短刨根器和手锯采取，尽可能将基物一小部分和标本一起采下。

枯枝上的标本可用剪枝剪采取。

为使标本不受损伤，采集时须做临时处理，采集肉质、蜡质、胶质标本，可放入漏斗形纸袋中（用光滑白纸，按标本大小，现用现做），菌柄向下，放入号牌，包好后放入纸盒中。

XXXX医院真菌标本采集标准操作规程1 目的规范真菌标本采集、接种培养及鉴定标准操作规程，确保检验结果准确可靠。

2 适用范围各类真菌检测的标本。

3 标本采集及处理3.1 标本类型痰、尿、粪、脓液、脑脊液、血、拭子、皮屑、甲屑、气管穿刺抽取的痰液等。

3.2 标本采集与处理3.2.1 痰液、气管穿刺抽取的痰液。

3.2.2 尿液：早晨中段尿10ml，离心收沉淀液1 ml，作真菌涂片及培养。

3.2.3 口腔、咽喉、外耳道、阴道、和直肠黏膜的标本：应迅速放入内装1 ~ 2 ml无菌蒸馏水的试管送检。

常规KOH涂片及SDA培养。

3.2.4 粪便：无菌盒送检，挑取黏液、脓血接种于含氯霉素培养基上。

3.2.5 脓液：脓液标本应置无菌广口有盖玻璃瓶或小的无菌平皿中，立即送检。

3.2.6 脑脊液：采集于无菌试管3 ~ 5 ml立刻送检，离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1 ml，作黑汁涂片镜检和培养（SDA）25℃及37℃1周。

3.2.7 血液：分别于左右两侧尢菌抽血3 ~ 5 mI，立即置于脑心浸出液肉汤。

3.2.8 体液：支气管积液、关节腔积液、心包积液、腹水等10ml，离心沉淀后取0.5ml沉淀液作直接镜检（注意颗粒）及培养。

3.2.9 组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌研钵或组织匀浆器加2 ml蒸馏水，研磨成浆或切成1 ~ 2 mm3的小块作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。

3.2.10 皮屑：皮损的边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑。

取材前用75％酒精棉球消毒取材处，标本作真菌直接镜检（KOH涂片）和培养。

3.2.11 甲屑：用细锉或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后以十点接种法分别种于含放线菌酮及不含放线菌酮的SDA平皿，25℃ ~ 28℃培养3周，并同时作KOH 涂片。

3.2.12 毛发：取病发15根、75%酒精消毒，3 ~ 5根作直接镜检，5 ~ 10根种于SDA斜面（加氯霉素），稍划破斜面掩埋。

大型经济真菌的标本采集1 整理和鉴定的基本方法(一)标本的采集方法和野外记录1．采集用具平底背筐或平底扁形手提筐，不同大小的厚纸盒若干个(或长方形铝、塑料饭合)若干个，小指管若干个，塑料袋若干个，木箱1—2个，液浸标本筒1—2个。

还应携带掘根器、手锯、短刀、小快刀、刀片、刨根斧、白报纸、纱布、竹制或塑料板制的号牌、棉线和细绳、钢卷尺、温度计、湿度计、测高计、酸碱度试纸、白色厚塑料布2～3块(每块5尺长)等等。

2．采集方法伞菌目、银耳目、肉座菌目、蜡钉菌目、盘菌目、腹菌类各目和一年生，多孔菌类，夏季和秋季最多，故夏、秋季是采集的适期。

但盘菌目的一些种如羊肚菌、马鞍菌和丛耳等多在春季末发生，过时即消失，因此也需及时采集。

多年生的多孔菌类一年四季均可采到，如专程采集多孔菌以春季和晚秋为宜。

采集地生菌类时，可用手轻捏基部，缓慢地将菌体转一周，然后拔出，尽量带出地下部的下部分，散去其泥土，保持其完整，不要污损各部，不要损坏其菌环和菌托；最好采集时带洁净的丝制手套以免触伤菌体。

如遇到丝膜属菌类，切勿伤其丝膜，尽量将其菌蕾、未开伞的幼体和已开伞的成熟体一齐采到。

菌盖上的附着物如落叶、小虫等也不要弹掉，菌盖上的鳞片、绒毛等要保持完整，盖缘的菌幕残片要注意保护。

有些种伞菌的菌柄在土壤中埋的很深，要用短刀或掘根器轻轻挖出，切勿损害地下部分和菌托。

有些菌柄的基部有根状菌索或绒毛，均应采全。

菌柄上的绒毛、鳞片等均要保持其完整。

腹菌类基部有菌索深入土中，要注意采取。

肉质、胶质和蜡质的标本，可轻放于漏斗状纸袋中(用光滑洁白的纸按标本大小现用现做)，菌柄向下，保持各部完整。

如正在散放孢子时可顺便取得孢子印，切勿在标本上贴手手印，放入号牌，包好，放于纸盒中。

如遇脆弱易于破损的标本或具丝膜或有菌幕残片的标本，可直接放于饭盒中，在其周围用洁净、稍干的藓类予以填充以防磨伤标本。

在稀褶黑菇和黑红菇的菌盖上可能见到小型丛生或群生的寄生菇[Asterophoralytoperdoiders S. F.Gray(Nyetalis asterophora Fr.)，要将寄生菇和寄主一同采取。

XXXX医院真菌标本采集标准操作规程1 目的规范真菌标本采集、接种培养及鉴定标准操作规程，确保检验结果准确可靠。

2 适用范围各类真菌检测的标本。

3 标本采集及处理3.1 标本类型痰、尿、粪、脓液、脑脊液、血、拭子、皮屑、甲屑、气管穿刺抽取的痰液等。

3.2 标本采集与处理3.2.1 痰液、气管穿刺抽取的痰液。

3.2.2 尿液：早晨中段尿10ml，离心收沉淀液1 ml，作真菌涂片及培养。

3.2.3 口腔、咽喉、外耳道、阴道、和直肠黏膜的标本：应迅速放入内装1 ~ 2 ml无菌蒸馏水的试管送检。

常规KOH涂片及SDA培养。

3.2.4 粪便：无菌盒送检，挑取黏液、脓血接种于含氯霉素培养基上。

3.2.5 脓液：脓液标本应置无菌广口有盖玻璃瓶或小的无菌平皿中，立即送检。

3.2.6 脑脊液：采集于无菌试管3 ~ 5 ml立刻送检，离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1 ml，作黑汁涂片镜检和培养（SDA）25℃及37℃1周。

3.2.7 血液：分别于左右两侧尢菌抽血3 ~ 5 mI，立即置于脑心浸出液肉汤。

3.2.8 体液：支气管积液、关节腔积液、心包积液、腹水等10ml，离心沉淀后取0.5ml沉淀液作直接镜检（注意颗粒）及培养。

3.2.9 组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌研钵或组织匀浆器加2 ml蒸馏水，研磨成浆或切成1 ~ 2 mm3的小块作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。

3.2.10 皮屑：皮损的边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑。

取材前用75％酒精棉球消毒取材处，标本作真菌直接镜检（KOH涂片）和培养。

3.2.11 甲屑：用细锉或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后以十点接种法分别种于含放线菌酮及不含放线菌酮的SDA平皿，25℃ ~ 28℃培养3周，并同时作KOH 涂片。

3.2.12 毛发：取病发15根、75%酒精消毒，3 ~ 5根作直接镜检，5 ~ 10根种于SDA斜面（加氯霉素），稍划破斜面掩埋。

真菌不染色标本采集注意事项一、标本采集前的准备工作1.了解采集地点：在采集之前，要对采集地点有所了解，包括地理环境、植被类型、气候条件等。

这有助于确定采集的目标物种和采集时间。

2.准备采集工具：采集真菌不染色标本需要一些专业的工具，如剪刀、手套、纸袋、塑料袋、标签等。

确保采集工具干净、锋利，并备好足够数量。

3.了解采集规范：熟悉相关的采集规范和标准，遵守采集伦理，保护环境，不破坏生态平衡。

同时，了解采集物种的保护情况，避免采集濒危物种。

二、采集方法1.选择适当的采集时间：真菌的生长和繁殖具有一定的季节性，不同物种的生长季节也不同。

在采集时，应选择适当的时间，以获得较好的标本。

2.选择合适的标本：在采集标本时，应选择外形完整、无病虫害的真菌，避免选择腐烂、变形或被其他生物侵蚀的标本。

同时，在采集时要注意不要过度采集，以免对真菌资源造成过度损害。

3.采集标本的方法：对于地上生长的真菌，可以使用剪刀将其切下，并尽量保持根部完整。

对于地下生长的真菌，可以小心地将土壤挖开，将其整体采集出来。

采集时要避免直接触碰真菌，以免破坏其外形。

4.采集标本的数量：在采集时，应根据需要采集足够数量的标本，以便进行后续的研究和鉴定。

同时，要注意不要过度采集，以免对真菌种群造成不必要的损害。

5.正确标注标本信息：在采集时，要及时在标本上标注相关信息，如采集地点、采集时间、采集者等。

这有助于后续的研究和鉴定工作。

三、标本保存与处理1.保存标本的方法：采集完标本后，应及时将其放入纸袋或塑料袋中，并尽量保持标本的完整性。

在保存过程中，要注意避免标本受潮、变形或被其他物品压坏。

2.标本的处理：采集回来的标本可以进行一些简单的处理，如清洗、剪裁、干燥等。

清洗时要小心操作，避免损坏标本。

剪裁时要保留标本的重要特征，以供后续的鉴定和研究。

3.标本的保存方式：真菌不染色标本的保存方式有多种选择，如干燥保存、液体保存等。

选择适合的保存方式，要根据标本的特性和后续的研究需求来确定。

大型真菌总DNA提取步骤
1、选取适量的硅胶干燥材料或从标本上切取适量组织放入1.5 ml离心管中，加入少量石英
砂，液氮冷冻，室温下用塑料研杵迅速用力研磨，直至材料呈粉末状，细腻均匀。

4、加入65℃预热的CTAB溶液500μl，充分混匀，65℃水浴1 h，10分钟轻摇一次。

5、在离心管中加入500μl的氯仿-异戊醇（V：V=24：1），轻摇10分钟，10000 r/min离心
10分钟，取上清。

6、再次在离心管中加入氯仿-异戊醇（V：V=24：1），加满离心管，轻摇10分钟，10000 r/min
离心10分钟，取上清。

7、加入满无水乙醇（-20℃预冷），轻摇，放于冰箱-20℃沉降4h 或过夜。

8、从冰箱中取出离心管，10000 r/min离心10分钟，弃上清，注意动作要轻。

9、-20℃预冷的75%乙醇10000 r/min离心2分钟洗两次，-20℃预冷的无水乙醇洗一次，每
次洗涤离心13000 r/min离心2分钟。

10、将离心管倒扣于通风橱内，风干2小时，使乙醇挥发。

干燥后，加入50 μl TE(或水)溶
液，摇床内36℃,保温30min（不摇晃），使DNA溶解。

11、吸取溶解好的DNA原液5μl加45μl水(或TE)，混匀后的工作液可直接用于PCR。

原
液则保存于-20℃备用。

第七章大型真菌我们通常所说的菌类，包括细菌、粘菌、卵菌和真菌等类群。

因此，“菌类”一词不是严格意义上的分类学词汇。

细菌属有原核生物界。

粘菌、卵菌和真菌具有真核，它们在林奈两界系统中属有植物界真菌门，在Wittaker（1969）五界系统中属于真菌界（Kingdom Fungi）。

按现在分类学观点，原来放在真菌界中的卵菌和粘菌等已从真菌中分出。

在生物八界系统（Cavalier-Smith, 1988－1989）中，卵菌和粘菌分别被归入假菌界（藻界）（Kingdom Chromista）和原生动物界（Kingdom Protozoa）。

真菌界只包括壶菌门（Chytridiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）。

菌类种类繁多，数量庞大，分布十分广泛。

子实体大小相差悬殊，它们大部分种类只有借助显微镜才能分辨清楚。

由于课堂上对于菌类的分类知识讲授甚少，在实习中仅要求初步掌握大型真菌（属有真菌界）的生物学性状和分类特征，并能识别大型真菌的主要类群和部分常见属种。

1 大型真菌的主要类群大型真菌是指子实体大型的子囊菌和担子菌，泛指广义上的Mushroom或Macrofungi，即译为蘑菇或蕈菌。

我国目前已知大型真菌3800种以上。

其中伞菌类1600种，多孔菌类1300种，腹菌类300种，木耳和银耳胶质菌类100余种，子囊菌类400多种。

根据实习的具体情况，下面仅对常见大型真菌的科属特征作简要介绍。

1.1子囊菌门（Ascomycota）1.1.1 麦角菌目（Clavicipitales）麦角菌科（Clavicipitaceae）子囊壳埋生在子座或菌丝层中；肉质子座或棉絮状的菌丝层浅色或深色，常为橘黄色；子囊圆筒状，细长，顶端加厚呈拱顶盖状，并具有狭长、线状孔口；子囊孢子无色，线形，初期无横隔，后渐形成多数横隔，最后由各横隔处断裂成单细胞小段。